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宋 玉，郑 健，黄 峰，李 侠，韩 东，张春晖,*
（1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193；
2.内蒙古西贝餐饮集团有限公司，内蒙古 呼和浩特 010000）
猪肉可以为人体提供高质量的蛋白质、酯类、维生素及矿物质，是人体营养的重要来源[1]。我国的肉制品加工也在逐步实现工业化和标准化，猪肉制品在我国的肉制品加工领域中占有重要地位[2-3]。腌制技术是肉制品加工中最常用的一种方法，中国的传统肉制品在热处理之前大多都会进行腌制处理[4]。腌制不仅可以防腐保鲜，还被赋予了改善肉类色泽和质构，增强肉制品的风味等作用[5-6]。
目前，中式肉制品加工中常用的腌制方式有湿腌、干腌和超声辅助腌制等。湿腌是将食盐溶解到水中，配制成一定浓度的食盐溶液，然后将肉样浸入盐水中进行腌制。湿法腌制具有肉质柔软、盐度易调节等优点，但容易造成原料浪费和营养物质流失[4]。干腌是直接将食盐或者其他腌制剂涂抹到肉样表面，依靠食品本身渗出的汁液和盐分混合形成腌制液进行腌制[6]。与湿腌相比，干腌制品具有延长保质期，营养物质流失较少的优点，但容易造成表面脱水，影响肉制品的质构和口感[7]。超声辅助腌制是近几年在肉品行业应用较多的一个新型腌制技术，具有缩短腌制时间，提高肉制品嫩度的优点[4]。
目前的研究多集中在腌制方式对鲜肉品质及理化特性的影响，不同腌制方式对肉制品品质的影响研究较少。此外，不同腌制方式下肉制品品质变化与组织形态和蛋白质结构的关系缺乏系统的研究。因此，本研究以猪背最长肌肉（Longissimus thoracis et lumborum muscle）为研究对象，研究了3 种常用的腌制方式（湿腌、干腌和超声腌制）对煮制猪肉品质（色泽、质构和保水性）、组织形态及蛋白结构的影响，并分析了热加工猪肉品质特性与组织形态和蛋白结构的关系，为不同腌制工艺在猪肉制品加工中的应用提供理论依据。
1.1 材料与仪器
三头杜长大三元杂交猪（6 月龄，120～150 kg），4 ℃冷却24 h 以上，取猪胴体左右两侧背最长肌北京当地的超市；
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
溴酚蓝 美国Amersco 公司；
H.E 染色试剂盒 索莱宝科技有限公司。
BSA423 S 电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；
KQ-500B 超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；
CR-400 色差仪 日本柯尼卡美能达公司；
TA-XTPlus 质构分析仪 英国Stable Micro Systems 公司；
C-LM3 数显嫩度仪 北京朋利弛科技有限公司；
MesoMR23-060H-1 低场核磁共振分析仪及成像系统 上海纽迈电子科技有限公司；
DH-101-3BS 电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；
HHS 型电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司；
NIKON CI-S 显微镜 日本尼康；
Bruker Tensor 27 傅里叶变换红外光谱 德国布鲁克光谱仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理 取3 头猪的左右两侧背最长肌，剔除可见的脂肪和结缔组织，将其切成5 cm×5 cm×5 cm，约100±5 g 的肉块后进行腌制处理，以未腌制的猪肉作为对照。
1.2.2 腌制处理 参考Qin 等[8]的方法，通过感官评定，确定达到适宜的咸度需要的腌制条件。湿腌：根据预实验的结果，配制10%质量浓度的食盐水溶液300 mL，将猪肉块按1:3（m/V）的比例浸入到食盐水溶液中，放在4 ℃的冰箱中腌制24 h。干腌：1.5%的食盐均匀涂抹在肉块表面，放在4 ℃的冰箱中腌制，直至食盐被肉样完全吸收。超声腌制：选用10%的盐水300 mL 与肉块一同放入自封袋中，使肉样完全浸没在盐水里，排气，封口，放入超声波清洗机中。超声功率：120 W，超声频率40 kHz，腌制时间45 min，加冰控温在4 ℃。在本试验中，三种腌制方式处理的肉样咸度相同，即含盐量相同。
1.2.3 煮制处理 参考Wang 等[9]的方法，将对照组和腌制后的肉块放入蒸煮袋中，加入2.5 倍纯水（以肉重为标准），然后在95 ℃水浴中加热，在肉的几何中心，使用温度监测仪监测肉块的中心温度，直到最终温度达到80 ℃，停止加热。煮熟后，立即将肉块放入水浴中冷却直室温（25 ℃），然后用纸巾擦去表面水分，备用于指标测定。
1.2.4 色泽 参考王静帆等[3]的方法，使用CR-400色差仪，CIEL*，a*和b*色度系统对煮制处理后肉样的色泽进行测量。在测量之前，先将色差仪通过矫正板（C：Y=93.5，x=0.3114，y=0.3190）进行校准。使用的光源为D65，观察角度为2°。测量孔径为8 mm，每块肉取6 个测量点，记录，取平均值。
1.2.5 质构 参考Cao 等[10]的方法，将不同处理组的煮制肉样沿着肌纤维的方向切成2 cm×2 cm×2 cm的肉块，使用质构仪测定肉样的硬度、黏性、咀嚼性、弹性和内聚性，所选探头型号为P50，测试前后的速度分别为2 和10 mm/s，测试速度为2 mm/s，肉样的形变量设置为40%，测试的时间间隔为5 s，探头触发类型设置为自动触发。
1.2.6 剪切力 将不同处理组的煮制肉样沿着肌纤维的方向切成肉条（1 cm×1 cm×3 cm），用Warner-Bratzler 探针垂直于肌肉纤维剪切肉条3 次，测量剪切力值。参数设置为：探头从阻力点降低25 mm，预试速度为5 mm/s，测试速度为10 mm/s，测后速度为10 mm/s。峰值力记录为肉样的剪切力值，结果用牛顿（N）表示。
1.2.7 出品率 生肉样品在腌制前称重，经过腌制，煮制，冷却过后，用滤纸擦干表面水平并再次称重。前后两次的重量的比值即为出品率（%）。出品率的计算公式如下所示：
1.2.8 水分含量 采用烘箱干燥法测定水分，参考GB 5009.5-2010 进行测定。称取煮制处理后的肉样约5 g，放入坩埚中，在105 ℃的烘箱中烘制，直至恒重为止。称取烘制前后的重量差，即为肉样的水分含量。
1.2.9 二维低场核磁（2D LF-NMR）分析 参考Wang 等[11]的方法进行水分分布的测量。不同处理组的煮制肉样被切成2 cm×2 cm×5 cm 的块状，重量约15 g，放入口径为60 nm 的核磁管中，放置于核磁共振分析仪中进行测量。采用IR-CPMG 序列进行二维T1-T2弛豫时间测量。核磁共振仪的设置参数为：工作温度32 ℃；
磁场强度：0.5 Tesla；
探头线圈直径：60 mm；
光谱仪频率：23 MHz；
90°和180°的脉冲时间分别为12 和24 μs；
对一个样本进行累计4 次的扫描。数据采用MultiExp Inv 软件进行分析，采用累积记分算法确定每组分的比例。通过多组分反演得到T2弛豫强度，通过单组分反演得到T1和T2的总弛豫强度。
1.2.10 氢质子密度图谱（MRI）分析 参考王策[12]的方法对煮制后的肉样进行MRI 测定，使用Meso MR23-060H-1 核磁共振分析及成像系统获得质子密度图像，具体成像参数设置如下：重复时间为500 ms，回波时间为20 ms，视场为50×50 mm2。利用拉梅尔定律（V=γB0/2Π）将样品分为三层进行测量，每层宽度为3.2 mm，切片间隙为1.8 mm。得到图像后，通过滤波处理调整信噪比，对图像进行伪彩处理。
1.2.11 微观结构分析 参考Jiang 等[13]的方法，取1 cm×1 cm×3 cm 的煮制肉样，用固定液（75%乙醇，25%乙酸）在4 ℃，固定24 h。用石蜡包埋，冷却后取出，然后进行4 μm 的切片，而后将组织黏粘于载破片上，在温水中干燥24 h，脱蜡。用苏木素染色5 min，然后用自来水冲洗，用1%盐酸乙醇分化，再用自来水冲洗，用1%氨水返蓝，用蒸馏水冲洗，然后用0.5%的伊红染液染色1 min，自来水冲洗。然后用乙醇脱水，用中性树胶封片，显微镜下观察。
1.2.12 表面疏水性 参考Mitra 等[14]的方法，将1 g煮制肉样与20 mL, 20 mmol/L PBS（pH7.0）混合，10000 g 均质30 s，用BCA 法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度为5 mg/mL。取1 mL 样品悬浮液与200 μL溴酚蓝（BPB）混合，室温下搅拌均匀。同时，取1 mL PBS 与200 μL BPB 结合，作为对照组。所有对照和检测样品在2000 g，4 ℃下离心15 min，取上清液，用PBS 稀释10 倍，在595 nm 处测定吸光值，结合BPB 的量（疏水性指数）计算肉样的表面疏水性。
1.2.13 蛋白二级结构 将冻干后的样品（2～6 mg）研磨成粉末，与溴化钾按1:200 的比例混合。根据Wang 等[9]的方法，使用傅里叶变换红外光谱仪记录样品的光谱。光谱扫描范围设置为400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1。用Peakfit 4.12 软件对谱图的酰胺I 波段（1700～1600 cm-1）进行二级结构分析。
1.3 数据处理
试验数据采用平均值±标准偏差表示，采用Origin 8.5 软件进行作图，使用SPSS 22.0 软件进行差异显著性分析，采用邓肯式对不同处理组间的差异进行统计学分析，P＜0.05 为显著性检验标准。使用统计编程R 语言（R Core Team, 2016）进行相关性分析。
2.1 不同腌制方式对煮制猪肉色泽的影响
肉制品的色泽是一个重要的肉品品质质量评价指标，显著影响了消费者的购买欲望。在肉品加工过程中，内部因素和外部因素共同影响肉色呈色品质，例如：加工工艺、蛋白与脂质氧化都能影响肌红蛋白的含量，从而影响肉色变化[15]。由表1 可知，对照组亮度值和红度值最低，说明腌制处理改善了肉制品的色泽属性。湿腌的煮制猪肉亮度值（L*）和黄度值（b*）高于干腌的煮制猪肉，红度值（a*）显著低于干腌处理的煮制猪肉（P＜0.05）。先前有研究报道肉制品的色泽受肉品水分含量的影响[16]，在3 种腌制方式中，干腌的煮制猪肉亮度值最低，可能与干腌处理导致肉样表面失水严重，造成光的反射降低有关。不同处理组肉样亮度的差异可能和结构变化引起的光散射有关[17]。与其他2 种腌制方式相比，超声腌制显著提高了煮制猪肉的红度值（P＜0.05），这可能与超声腌制促进了亚硝基肌红蛋白的生产有关[4]。
表1 不同腌制方式对煮制猪肉色泽的影响Table 1 Effects of different salting methods on color of cooked pork meat
2.2 不同腌制方式对煮制猪肉质构的影响
肉制品的质构也是评价肉品品质的重要指标。由表2 可知，与对照组相比，煮制猪肉的硬度、咀嚼性和剪切力显著降低（P＜0.05），说明腌制处理提高了肉制品的嫩度。湿腌的煮制猪肉硬度、咀嚼性和剪切力值都显著低于干腌的煮制猪肉（P＜0.05）。湿腌的煮制猪肉内聚性与干腌的煮制猪肉差异不显著（P＞0.05）。干腌的煮制猪肉黏性和内聚性均显著低于超声腌制的煮制猪肉（P＜0.05），但硬度、咀嚼性和剪切力显著高于超声腌制的煮制猪肉（P＜0.05）。与湿腌相比，干腌肉样的表面失水更多，所以导致煮制猪肉表面硬化和黏性降低。先前的研究表明，肉样嫩度的增加与保水性具有相关性[15]，也证实了肉样嫩度越大，保水性越强，表现为自由水比例低，水分含量高。在3 种腌制方式对比中，超声腌制的煮制猪肉具有最高的黏性和内聚性，最低的硬度、咀嚼性和剪切力。不同处理组之间肉样的弹性差异不显著（P＞0.05），说明腌制处理与腌制方式对肉制品弹性影响不大，黄瀚[6]在对不同腌制方式对兔肉及其产品加工过程品质的影响研究中，也得出了类似的结论。此外，与湿腌和干腌处理相比，超声腌制过程中，会有更多的蛋白渗出，从而造成煮制猪肉的结构更致密，提高了其黏度和内聚性[6]。腌制方式会不同程度地破坏肉制品的结构，超声腌制的空化效应可能破坏了肌原纤维蛋白的结构，提高了传质效率和蛋白溶解，降低了肉样的剪切力和硬度[18]。
表2 不同腌制方式对煮制猪肉质构的影响Table 2 Effects of different salting methods on texture analysis of cooked pork meat
2.3 不同腌制方式对煮制猪肉保水性的影响
2.3.1 出品率和水分含量 保水性是肉制品重要的食用品质之一，其中出品率和水分含量是衡量熟肉品质的重要指标。肉制品加工过程中，出品率还具有一定的经济意义。肉制品出品率的降低是肉品中的水分和可溶性物质的流失导致的，加热过程中，腌制会促进盐溶性蛋白的溶出，阻止水分流出。由表3 可知，对照组肉样出品率最低，水分含量最低，说明腌制处理提高了猪肉制品的得率和保水性。此外，本研究中，不同的腌制方式显著影响了煮制猪肉的出品率和水分含量（P＜0.05）。湿腌过程中，盐溶性蛋白溶出，富集在肉块表面，加热后形成凝胶，降低了煮制猪肉的蒸煮损失，提高了出品率[6]。干腌处理导致肉样渗透脱水，因此，干腌处理的煮制猪肉的水分含量低于湿腌处理的煮制猪肉[19]。与其他2 种腌制方式相比，超声腌制的煮制猪肉出品率最高，水分含量最高。超声处理导致盐渗透性增加，会使腌制液更加均匀，迅速地渗透到肉的孔隙中，提高了肌原纤维蛋白的肿胀和水分结合能力，降低了热加工过程中的水分流失，提高了肉制品的水分含量[18]。Siró等[20]的研究也表明超声波腌制的肉样比静态腌制的肉样具有更好的水分结合能力。
表3 不同腌制方式对煮制猪肉出品率和水分含量的影响Table 3 Effects of different salting methods on yield and water content of cooked pork meat
2.3.2 水分分布 低场核磁共振弛豫法已被用于探究肉品中水分分布，并提供蛋白质的完整信息，揭示蛋白质与水分的互作关系[12]。先前的研究主要集中在低场核磁共振的横向弛豫（T2），对纵向弛豫（T1）的研究较少。样品由受激发状态到恢复平衡状态的过程，称为样品的纵向弛豫，也称作自旋-晶格弛豫，其弛豫的快慢用纵向弛豫时间T1来表征[11]。T2是表征信号衰减快慢的时间常数称为自旋-自旋弛豫时间或者横向弛豫时间[21]。不同处理导致肉样中水分子与大分子的结合发生变化，从而导致横向弛豫和纵向弛豫强度的差异。图1 为不同处理组肉样的二维低场核磁共振图谱。由图1 可知，不同处理组肉样的横向和纵向弛豫具有显著的差异（P＜0.05）。如表4所示，未腌制的煮制猪肉横向和纵向弛豫信号最弱，说明未腌制的煮制猪肉肌原纤维内的水分含量最低。腌制处理显著提高了热加工猪肉的质子弛豫强度和水分流动性。Shao 等[22]研究表明，肌肉组织内水分流动性的提高是由于蛋白质间静电斥力的增加。超声腌制的煮制猪肉横、纵弛豫信号最强，可能因为超声腌制导致肉样中大分子相互作用发生了变化或者组织结构内的水发生了重组[23]，从而导致最高的T1和T2弛豫强度。此外，低场核磁共振通过横向弛豫时间可以反映出肉制品中三种不同形态的水。其中，横向弛豫时间T2b（1～10 ms）、T21（10～100 ms）和T22（100～1000 ms）分别代表结合水、不易流动水和自由水。P2b、P21和P22分别代表结合水、不易流动水和自由水的比例[21]。结合水指的是与蛋白质结合的水，不易流动水主要指肌原纤维内部的水，自由水对应于肌原纤维晶格外和肌细胞外的水[21]。由表4 可知，不同处理组肉样中结合水的横向弛豫时间（T2b）和比例（P2b）差异不显著（P＞0.05）。超声腌制的肉样不易流动水的弛豫时间（T21）和比例（P21）显著高于其他腌制方式（P＜0.05），说明超声辅助湿腌提高了肉制品的保水性，与Sun 等[24]的结果一致。相关研究表明，自由水的增加与肉制品的保水性降低有关[25]。本研究中采用的3 种腌制方式中，干腌的煮制猪肉自由水比例（P22）最高（表4），说明干腌的煮制猪肉的水分流失最多，水分含量最低（表3）。
2.3.3 氢质子密度成像 利用低场核磁共振成像技术，可以将肉样内部的氢质子形成的信号强度转换成密度图谱，从而反映出水分在肉样中的空间分布情况，使样品的水分含量实现可视化[26]。在氢质子密度图像上，蓝色区域代表结合水，代表较弱的信号强度，红色区域代表不易流动水和自由水，代表较强的信号强度。图像越亮，红色区域越多，代表样品的水分含量越多[12]。本研究中，对照组肉样中蓝色区域最多，红色区域最少，说明未腌制的煮制猪肉中氢质子密度最低，水分流失最多。Bouhrara 等[27]报道了较低的氢质子密度与水分的旋转迁移率降低有关。由图2可知，湿腌的煮制猪肉红色区域高于干腌肉样，蓝色区域少于干腌肉样，说明湿腌肉样的水分含量高于干腌肉样，干腌肉样的水分流失较多。超声腌制的肉样具有最多的红色区域，说明超声导致水分流动性增强，水分含量最高，保水性最强。
图2 不同腌制方式的煮制猪肉的氢质子密度图像Fig.2 Hydrogen proton density images of cooked meat samples in different treatment groups
2.4 不同腌制方式对煮制猪肉组织形态的影响
由图3 可知，腌制条件显著影响了煮制猪肉的组织形态，未腌制的煮制猪肉肌纤维程度最大，肌纤维边界最明显。在3 种腌制方式的对比中，超声腌制的煮制猪肉肌纤维中的裂痕较多，肌纤维间的界线较模糊，侧向肿胀最明显。超声腌制可有效破坏肌纤维的结构，促进盐离子扩散，造成肌纤维晶格的肿胀。氯离子与蛋白丝的结合，增强了肌原纤维之间的静电斥力，扩大了肌纤维的比表面积，使肉样样品的水化能力增强[25]。干腌的煮制猪肉肌细胞内肌原纤维收缩，导致细胞间隙增加，这种收缩可能在某种程度上引起肉样硬度增加[26]。通过纵切面可观察到，三个处理组的煮制猪肉肌纤维都出现不同程度的断裂。与其他2 种腌制方向相比，超声腌制可能通过改变肌纤维结构促进肌膜的分离降解，提高肉样的嫩度和保水性。康大成[4]报道了腌制过程中肌纤维结构的破坏有利于保水性和嫩度的提高，与本研究的测定结果一致。组织形态的结果进一步解释了煮制猪肉保水性和质构的变化。
图3 不同腌制方式后煮制猪肉的组织形态Fig.3 Microstructural changes of muscle fiber structure of cooked meat samples in different treatment groups
2.5 不同腌制方式对煮制猪肉蛋白结构的影响
2.5.1 表面疏水性 蛋白质的表面疏水性是非极性氨基酸残基侧链之间的疏水相互作用，可用来表征蛋白质的三级结构变化[10]。由图4（A）得，不同腌制方式对煮制猪肉表面疏水性影响显著（P＜0.05）。对照组肉样蛋白表面疏水性低于腌制处理组肉样的表面疏水性，说明腌制处理提高了蛋白质结构的展开程度。超声波的机械效应可改变蛋白质空间结构，疏水基团暴露，表面疏水性增加[4]。Mitra 等[14]报道了热加工猪肉表面疏水性的增加与蛋白质结构中氢键的断裂和蛋白质聚集程度增加有关。
图4 不同处理组猪肉蛋白表面疏水性和二级结构的相对含量变化Fig.4 Changes of relative content of protein surface hydrophobicity and secondary structure in meat samples at different treatment groups
2.5.2 蛋白二级结构 酰胺I 带（1600～1700 cm-1）代表C=O 和一小部分C-N 伸缩振动，能提供蛋白质二级结构的信息，可以进一步分析不同腌制方式对煮制猪肉蛋白结构的影响。猪肉经过腌制、煮制处理后，蛋白质结构从有序的螺旋结构转变成伸展结构。由图4（B）得，对照组肉样的蛋白二级结构与干腌处理组差异不显著（P＞0.05），与湿腌和超声腌制的煮制猪肉差异显著（P＜0.05）。不同腌制方式对蛋白质二级结构的影响可能与氢键强度有关，氢键强度随着盐浓度的增加而减弱[28]。本研究中，超声腌制的煮制猪肉α-螺旋和β-转角含量最低，同时β-折叠和无规卷曲的含量最高，说明超声波辅助腌制破坏了肌球蛋白结构，肌原纤维蛋白的聚集性增加[29]。Sun 等[24]研究表明，超声波处理降低了α-螺旋含量，提高了无规卷曲的含量，可能因为超声处理引起蛋白质降解，产生了更小的蛋白质片段。此外，湿腌的煮制猪肉的α-螺旋和β-转角的含量显著低于干腌的煮制猪肉（P＜0.05），β-折叠的含量显著高于干腌的煮制猪肉（P＜0.05）。湿腌和超声腌制样品的无规卷曲含量显著高于对照组和干腌样品无规卷曲的含量（P＜0.05），湿腌样品和超声腌制样品的无规卷曲含量差异不显著（P＞0.05）。α-螺旋含量的降低与疏水基团有关，疏水基团参与了蛋白质的聚集[29]。腌制过程中，蛋白质基质中α-螺旋的含量至关重要，因为α-螺旋转化为β-折叠是腌制过程的驱动因素，可使更多的水分困在肌纤维蛋白网络中[28]。蛋白质二级结构的变化进一步影响了蛋白质与水分子间交联的平衡，从而影响煮制猪肉中的水分分布。
2.6 不同腌制方式处理的煮制猪肉各指标间的关系
为了研究不同处理组猪肉样品的品质与蛋白质结构的相关性，对肉样的各品质指标与蛋白结构进行了主成分分析和Pearson’s 相关性分析。由主成分分析结果（图5A）可知，三个不同处理组的样品分布在不同的位置，说明不同处理组之间差异显著（P＜0.05）。由图5（A）可知，第1 主成分占总方差贡献率67.36%，第2 主成分占9.29%，累计贡献率为76.65%。图5（B）为各个品质指标之间的相关性分析。例如，水分含量与剪切力、硬度、咀嚼性、P22、α-螺旋和β-转角呈显著负相关（P＜0.05），与出品率、L*、a*、内聚性、黏性、T21、T22、P21、T1、T2、表面疏水性、β-折叠和无规卷曲呈显著正相关（P＜0.05），与b*、弹性、T2b和P2b无显著相关性（P＞0.05）。本研究结果表明，不同的腌制方式对煮制猪肉品质特性影响显著（P＜0.05），肉制品的色泽，质构和保水性与蛋白结构变化密切相关。
图5 不同腌制方式的煮制猪肉各指标间的相关性分析Fig.5 Correlation analysis of quality traits of cooked meat samples in different treatment groups
不同腌制方式对肉制品品质影响显著，腌制处理改善了肉制品的色泽、质构和保水性。在三种腌制方式的对比中，超声腌制的煮制猪肉表现出更好的色泽、保水性和质构特性。超声腌制的煮制猪肉肌纤维肿胀更明显，肌纤维中的裂痕最多，肌纤维结构损伤最严重。肌纤维组织形态的结果可用于解释煮制猪肉保水性和质构特性的变化。此外，超声腌制的煮制猪肉蛋白表面疏水性最高，α-螺旋和β-转角含量最低，说明蛋白质结构的展开和聚集程度最高，蛋白质结构的变化与肉品质显著相关。本研究的结果为猪肉制品的加工提供了理论依据。
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