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王 菲, 时美红
(扬州大学附属医院 检验科, 江苏 扬州, 225100)
原发性干燥综合征(pSS)是慢性炎症性自身免疫性疾病干燥综合征(SS)的一种类型，不合并其他自身免疫性疾病，在结缔组织疾病中占比较高，并由淋巴细胞介导，会导致患者唾液腺、泪腺等外分泌腺体功能减退或丧失，表现出口干、眼干等干燥症状，但其发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、感染、内分泌等因素有关[1-3]。研究[4]报道，抗干燥综合征抗原A(SSA)抗体、抗干燥综合征抗原B(SSB)抗体、抗核抗体(ANA)是pSS最常见的自身抗体，其存在是诊断pSS的主要依据之一，与pSS病情显著相关。
BTB/POZ结构域蛋白7(BTBD7)是近年来新发现的上皮间质转化调控的关键因子，能够降低上皮钙黏素(E-cadherin)表达，进而破坏细胞间的黏附关系，促进恶性肿瘤的浸润、转移[5-6]。有研究[7-8]发现，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在自身免疫性疾病中发挥重要作用，其异常升高会造成细胞外基质、基底膜组织损伤，破坏细胞间的黏附关系，导致淋巴细胞浸润侵袭性增强。目前研究[9]发现MMP-9在pSS中存在异常表达，但BTBD7在pSS中的表达情况尚缺乏研究。本研究检测pSS患者唇腺组织中BTBD7、MMP-9表达水平，并分析二者与pSS患者自身抗体ANA、抗SSA抗体、抗SSB抗体的关系，现将结果报告如下。
1.1 一般资料
选取2016年9月—2020年10月在本院首次诊断为pSS的46例患者唇腺组织为pSS组，其中女44例，男2例，年龄27～76岁，平均(51.36±8.74)岁，均已发生唇腺淋巴细胞浸润，尚未接受治疗。另选取同期怀疑为pSS但最后排除诊断的46例口干燥症患者的唇腺组织为对照组，其中女45例，男1例，年龄31～80岁，平均(52.44±9.35)岁。2组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。所有组织样本离体后立刻用生理盐水清洗、液氮速冻，然后置于-70 ℃低温冰箱中长期保存。纳入标准: ① 符合2016年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟制定的pSS分类标准者[10]; ② 本研究方案经本院伦理委员会审核通过后实施; ③ 所有受试者均知晓此次诊治方案，并自愿签署知情同意书。排除标准: ① 合并高血压、糖尿病、丙型肝炎、结节病、器官功能异常及其他自身免疫性疾病者; ② 有头颈部放疗史者; ③ 处于妊娠期、哺乳期者; ④ 中途退出研究者。
1.2 主要试剂与仪器
TRIzol试剂、SYBR Green PCR master mix(货号: 15596026、4312704)购自美国Invitrogen; 逆转录试剂盒(货号: 205111)购自德国QIAGEN; RIPA裂解液(货号: 28192)购自加拿大Norgen Biotek; BCA试剂盒(货号: 701780-480)购自美国Cayman; 兔抗人一抗BTBD7抗体、MMP-9抗体、GAPDH抗体，HRP标记的羊抗兔IgG二抗(货号: ab154685、ab38898、ab245355、ab6271)购自abcam公司; ANA检测试剂盒(货号: H300L)购自美国SCIMEDX; 抗核抗体谱(IgG)检测试剂盒(货号: DL 1590-1601-1 G)购自欧蒙医学诊断(中国)有限公司; ECL试剂盒(货号: AS16-ECL-SN)购自瑞典Agrisera。荧光定量PCR仪(型号: ABI 7500)购自美国Applied Biosystems; 凝胶成像系统(型号: MG8000)购自美国Thmorgan; 荧光显微镜(型号: 80i)购自尼康公司; 免疫印迹仪(型号: EURO Blot MasterⅡ)购自欧蒙公司。
1.3 唇腺组织中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平检测
将2组的唇腺组织从冰箱中取出，在冰上解冻，分为2份。先取1份样本，加Trizol匀浆，提取总RNA, 测定RNA纯度、浓度合格后，使用逆转录试剂盒在PCR仪上合成cDNA，参照SYBR Green PCR master mix配制反应体系后，在荧光定量PCR仪上扩增，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法表示BTBD7mRNA、MMP-9mRNA水平，其中Ct值为扩增产物荧光信号达临界阈值时的循环数, △Ct=Ct待测基因-Ct内参基因, △△Ct=△Ct测试组织中待测基因-△Ct对照组织中待测基因。引物序列: ①BTBD7上游为5′-CTGAGCCACTGACAGGAGAGG-3′, 下游为5′-GATCCAGCAGCCTCTTTTCATCC-3′; ②MMP-9上游为5′-ATCCAAGGCCAATCCTACT-3′, 下游为5′-CGTCGAGTCAGCTCGGGT-3′;③GAPDH上游为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′, 下游为5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。
再另取1份样本，加入含1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF的预冷RIPA裂解液，将组织研磨匀浆、充分裂解, 12 000×g离心5 min, 分离上清液(即总蛋白)，用BCA试剂盒对总蛋白进行定量。各样本取总蛋白40 μg, 加入上样缓冲液，用沸水煮沸5 min, 将总蛋白充分变性，进行10% SDS-PAGE凝胶电泳将目的蛋白分离，然后将目的蛋白转印到PVDF膜上; 在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h, 按比例加入一抗稀释液(BTBD7抗体、MMP-9抗体、GAPDH抗体，均为1∶1 000稀释)在4 ℃下孵育过夜，PBS洗涤3次，加入二抗稀释液(HRP标记的羊抗兔IgG抗体, 1∶1 500稀释)室温下孵育1 h, PBS洗涤3次，加入ECL显色液显色，凝胶成像仪下观察、扫描图像。采用Image J软件测定各条带的灰度值，将目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白表达量。
1.4 自身抗体指标
收集所有pSS患者的检验科原始数据，记录并整理血清自身抗体ANA、抗SSA抗体、抗SSB抗体的数据，其中ANA检测采用间接免疫荧光法，具体操作严格按照ANA检测试剂盒、荧光显微镜操作步骤执行，抗SSA抗体、抗SSB抗体检测采用线性免疫印迹法，具体操作严格按照IgG检测试剂盒、免疫印迹仪操作步骤执行。根据数据分析结果将46例pSS患者分为抗SSA抗体阴性22例与抗SSA抗体阳性24例，抗SSB抗体阴性34例与抗SSB抗体阳性12例，以及ANA阴性4例与ANA阳性42例。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析。计量资料均呈正态分布，采用均数±标准差描述，组间比较行t检验; 采用Pearson相关分析法分析pSS患者唇腺组织中BTBD7蛋白表达水平与MMP-9 蛋白表达水平的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 2组患者唇腺组织中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平比较
与对照组相比, pSS组患者唇腺组织中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。
表1 2组患者唇腺组织中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平比较
2.2 pSS患者唇腺组织中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平与血清自身抗体的关系
在pSS患者的抗SSA抗体、抗SSB抗体以及ANA的检测结果中，各抗体阳性者唇腺组织中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平均高于阴性者，差异均有统计学意义(P<0.05), 见表2。
表2 不同血清自身抗体结果的pSS患者唇腺组织中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平比较
2.3 pSS患者唇腺组织中BTBD7蛋白表达水平与MMP-9 蛋白表达水平的相关性
相关性分析结果显示, pSS患者唇腺组织中BTBD7蛋白表达水平与MMP-9蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.493,P<0.05)。见图1。
研究[11-12]发现，SS发病是因机体自身免疫过度应答而引起外分泌腺存在大量淋巴细胞、浆细胞浸润，致使腺体细胞被大量破坏，表现出口干、眼干、发热、乏力等一系列临床症状[13]。SS可分为pSS和继发性SS, 其中pSS不合并其他自身免疫性疾病，而继发性SS则会同时表现出SS及其他疾病的症状[14]。pSS主要侵犯唇腺和泪腺，病理性变化为大量淋巴细胞浸润、组织间质纤维化及腺体组织萎缩等，临床表现为口唇干燥、口渴、难以进食干硬食物、舌体干裂等，严重影响患者的身体健康[15-17]。
BTBD7基因定位于染色体14q32.12区域，约有1 233 bp, 能引导上皮细胞发生“分支形态”改变过程，是近年来新发现的癌基因，在调控肿瘤细胞发生上皮-间质转化方面具有重要功能[18]。CHEN B等[5]研究显示，BTBD7可促进前列腺癌的增殖、侵袭及上皮-间质转化，加速肿瘤进展。杜望磊等[19]研究表明, E-cadherin在pSS患者唇腺组织中呈异常低表达，其表达情况与病理等级相关，参与pSS发病机制，推测BTBD7可能通过影响E-cadherin表达在pSS发病中发挥作用。本研究结果显示, pSS患者唇腺组织中BTBD7mRNA及BTBD7蛋白表达水平较口干燥症患者显著升高，提示BTBD7参与pSS发生过程。由于E-cadherin能够阻止淋巴细胞的侵袭，推测BTBD7可能在pSS发病过程中发挥调控上皮-间质转化过程的作用，能增强淋巴细胞的侵袭性，促进淋巴细胞浸润发生。pSS自身抗体ANA、抗SSA抗体、抗SSB抗体可反映pSS病情，其阳性结果对pSS具有较高的诊断价值。本研究结果显示，抗SSA抗体阳性、抗SSB抗体阳性以及ANA阳性的pSS患者唇腺组织中BTBD7蛋白表达水平较上述抗体阴性者显著升高，提示BTBD7表达与pSS患者血清ANA、抗SSA抗体、抗SSB抗体水平关系密切，可反映pSS病情。
pSS发病伴随大量淋巴细胞浸润，而细胞的浸润过程与细胞间的黏附关系有密切联系。MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员，其主要作用是降解细胞外基质及基底膜，打破细胞发生转移、浸润的天然组织屏障，促进细胞的侵袭、转移、浸润过程[20]。杜望磊等[19]研究发现，MMP-9在pSS患者唇腺组织中高表达，与病理等级相关，可能参与pSS的致病过程。AOTA K等[21]研究发现, MMP-9在pSS患者唇唾液腺中表达上调，可调节CXC基序趋化因子10表达及活性，有望成为pSS的新型疗法。SHAH N R等[22]研究也表明, MMP-9在pSS患者唇唾液腺中的mRNA及蛋白水平均显著上调。本研究结果显示, pSS患者唇腺组织中MMP-9mRNA及MMP-9蛋白表达水平较口干燥症患者显著升高，提示MMP-9参与pSS的发生过程; 进一步比较发现, ANA阳性、抗SSA抗体阳性以及抗SSB抗体阳性的pSS患者唇腺组织中MMP-9蛋白表达水平均显著高于对应抗体阴性患者，提示MMP-9可影响pSS患者自身免疫状况。本研究相关性分析结果表明, pSS患者唇腺组织中BTBD7蛋白水平与MMP-9蛋白水平呈正相关，表明二者可能共同影响pSS患者的自身免疫状况。
综上所述, pSS患者唇腺组织中BTBD7、MMP-9均呈高表达，且与自身抗体的抗SSA抗体、抗SSB抗体、ANA表达密切相关，可能共同影响患者自身免疫状况。
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