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王 审 许铭明 叶紫恒 屠俊杰
心血管疾病是全球心脏病患者死亡的主要原因之一，具有高死亡率和高致残率特性[1]。其中，再灌注是缺血性心血管疾病最有效的治疗方法之一，但是缺血再灌注损伤会进一步加重心肌细胞死亡[2]。目前减少心肌缺血再灌注损伤的治疗效果十分有限[3]。涤痰活血舒痹汤（Ditan Huoxue Shubi Decoction，DHS）在治疗心脏疾病方面具有良好效果，其主要组成为瓜蒌皮、瓜蒌子、薤白和生丹参等。丹参、瓜蒌和薤白能通过抑制血小板聚集和抑制凝血功能等使血液黏稠度降低，提高心肌血氧供应进而保护心脏[4-6]。DHS是否能够缓解心肌缺血再灌注损伤鲜有相关报道。此外，microRNA（miRNA）与造血、细胞增殖和细胞凋亡等生理过程有关，例如miR-26a-5p 可通过调节PTEN/PI3K/AKT 通路来保护心肌缺血再灌注损伤[7]。研究显示，瓜蒌丹参颗粒能够通过上调miR-155 的表达来改善心脏疾病[8]。因此，本文深入研究DHS 通过调控miRNA 保护心肌缺血再灌注损伤的分子机制，为心肌缺血再灌注损伤患者提供新的治疗手段。
1.1 动物及细胞 30 只健康雄性SD 大鼠（8 周龄，240～260 g）购自浙江中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证：SYXK（浙）2021-0012，伦理批号：IACUC-20210809-14，饲养环境通风良好，温度、相对湿度适宜，12 h 光暗循环，大鼠均标准饲料喂养，不禁食水。胚胎大鼠心肌细胞H9c2 细胞系购自中国科学院细胞库（批号GNR5）。
1.2 药物 DHS（瓜蒌皮、瓜蒌子各12 g，薤白10 g，姜半夏9 g，生川芎12 g，生丹参20 g，红曲3 g，茯苓15 g 和红景天12 g）购自浙江中医药大学附属第二医院。
1.3 试剂 miR-NC（miRNA 阴性对照）、miR-148a 拮抗剂、OE-NC（过表达阴性对照）和硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）过表达质粒由上海吉玛生物公司构建；
Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）（批号5023）、B 淋巴细胞瘤2（Bcl-2）（批号3498）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）（批号9661）、TXNIP（批号14715）、微管相关蛋白轻链3Ⅰ/3Ⅱ（LC3-Ⅰ/Ⅱ）（批号4108）、p62（批号23214）和Beclin-1（批号3495）购自美国Cell Signaling Technology 公司；
CCK-8 试剂盒（批号CA1210）、TUNEL 试剂盒（批号T2190）和BCA 试剂盒（批号PC0020）等购自北京Solarbio 公司；
miRNA 逆转录试剂盒（批号B532453-0020）购于上海生工生物工程有限公司。
1.4 实验仪器 酶标仪（型号：680）、实时荧光定量PCR 仪（型号：9600）和电泳仪（型号：1658001）购自美国Bio-Rad 公司；
冷冻高速离心机（型号：Sorvall Legend Micro）购自美国Thermo 公司；
荧光倒置显微镜（型号：CKX53）购自日本Olympus 公司。
2.1 DHS 及大鼠血清制备（1）DHS 制备：将药材加入450 mL 水浸泡30 min，煮沸后文火慢煎40 min并趁热过滤；
二煎加270 mL 水，文火慢煎40 min 并趁热过滤，合并2 次滤液并浓缩备用。（2）“血瘀”型大鼠模型建立：首先给大鼠腹腔注射维生素D3 70万IU/kg，分3 次，每2 d 注射1 次，然后各组每日每只给予高脂饲料20 g，连续喂饲2 周。（3）血清制备：“血瘀”型大鼠用1 mL DHS 水煎液[1 mL/100g，含生药材剂量为9 g/（kg·d）]早晚各灌胃1 次，实验过程中大鼠自由饮食且每天灌胃，共8 d。然后，采集大鼠的全血并在4 ℃下静置30 min，经离心、过滤、水浴和灭活后获得大鼠含药血清。同时，对照组SD 大鼠灌胃蒸馏水（1 mL），其血清用作对照组即大鼠空白血清。最后储存在-20°C 冰箱中备用。
2.2 细胞模型制备 将大鼠心肌细胞H9c2 在DMEM 培养基中于37℃和5% CO2培养箱中培养24 h。然后，将H9c2 细胞在37 ℃、0.1% O2、5% CO2和95% N2的缺氧条件下培养箱中培养，随后H9c2细胞在5% CO2和95%空气的复氧培养箱中培养2 h，构建心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型[9]。对照组为正常培养的H9c2 细胞。
2.3 CCK-8 检测 按照CCK-8 试剂盒说明书检测H9c2 细胞增殖情况，将H9c2 细胞（5×103/孔）接种于96 孔板中，按相应条件处理后加入CCK-8 溶液培养4 h，去上清后加入DMSO 溶解，通过酶标仪检测450 nm 处的OD 值。H9c2 细胞活性（%）=（实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。
2.4 TUNEL 染色 将H9c2 细胞（1×106/mL）接种到96 孔板中，使用4%多聚甲醛固定液固定H9c2 细胞30 min，加入0.2% Triton X-100 孵育10 min。然后，用PBS 缓冲液清洗H9c2 细胞3 次后，将H9c2 细胞与TUNEL 溶液在37 ℃下孵育60 min，并用DAPI 处理H9c2 细胞。最后，在荧光显微镜下观察染色的H9c2 细胞。
2.5 Western blot 检测 通过裂解液裂解H9c2 细胞，通过BCA 试剂盒测定蛋白浓度，经电泳后转移至PDVF 膜中，用5%脱脂牛奶密闭1 h 后并与一抗（Bax，1∶1000；
Bcl-2，1∶1000；
cleaved caspase-3，1 ∶1000；
TXNIP，1 ∶500；
LC3-Ⅰ/Ⅱ，1 ∶1000；
p62，1 ∶1000；
Beclin-1，1∶000；
β-actin，1∶1000）在4 ℃过夜，后与二抗山羊抗兔IgG（1∶2000）反应1 h，随后通过ECL 显色来获取显色蛋白条带。
2.6 qRT-PCR 检测 运用Trizol 试剂获取H9c2 细胞的总RNA，利用miRNA 逆转录试剂盒合成cDNA，miR-148a 通过miRNA 荧光定量PCR 试剂盒进行qRT-PCR 检测。以U6 为内参，使用2-ΔΔCT法计算miR-148a 的相对表达水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：miR-148a F：5"-GCGCGTCAGTGCACTACAGA-3"，R：5"-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3"；
U6 F：5"-AACGCTTACGAATTTGCGT-3"，R：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"。
2.7 统计学方法 数据运用GraphPad Prism 8.0 软件统计分析，符合正态分布的数据采用均数±标准差（）表示，两组间数据比较采用独立样本t 检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，P<0.05 认为差异有统计学意义。
3.1 miR-148a 在体外H/R 细胞模型表达下调 与对照组比较，H/R 组H9c2 细胞活力显著降低（P<0.01）；
H9c2 细胞凋亡水平显著上升，抗凋亡相关蛋白Bcl-2 下调而促凋亡蛋白Bax 和cleaved caspase-3 的表达水平显著上调。自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表达水平显著增加而p62 表达降低。H/R组miR-148a 表达下调（P<0.05）。见表1，图1。
图1 miR-148a 在体外H/R 细胞模型表达
表1 各组H9c2 细胞活力和miR-148a 相对表达水平比较（）
表1 各组H9c2 细胞活力和miR-148a 相对表达水平比较（）
注：对照组为正常培养的H9c2 细胞；
H/R 组为缺氧/复氧诱导的H9c2细胞；
与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01
3.2 DHS 上调miR-148a 表达减轻心肌缺血再灌注损伤 与H/R+空白血清组比较，H/R+含药血清组miR-148a 表达上调（P<0.01），H9c2 细胞活力显著增加（P<0.01），细胞凋亡水平显著下降。见表2，图2。
图2 DHS 上调miR-148a 表达减轻H/R 细胞损伤
表2 各组miR-148a 相对表达水平和H9c2 细胞活力比较（）
表2 各组miR-148a 相对表达水平和H9c2 细胞活力比较（）
注：H/R+空白血清组为大鼠空白血清处理H/R 组细胞；
H/R+含药血清组为大鼠含药血清处理H/R 组细胞；
H/R 为缺氧/复氧；
与H/R+空白血清组比较，aP<0.01
3.3 DHS 通过miR-148a 调控TXNIP 表达 与H/R+空白血清组比较，H/R+含药血清组miR-148a 表达上调，通过miR-148a 拮抗剂可降低miR-148a 水平（P<0.01）。与H/R+空白血清组比较，H/R+含药血清组TXNIP 表达下调；
而进一步加入miR-148a 拮抗剂，细胞中的TXNIP 表达显著上调。见表3，图3。
图3 DHS 通过miR-148a 来调控TXNIP 蛋白表达
表3 各组miR-148a 相对表达水平比较（）
表3 各组miR-148a 相对表达水平比较（）
注：H/R+空白血清组为大鼠空白血清处理H/R 组细胞；
H/R+含药血清组为大鼠含药血清处理H/R 组细胞；
H/R+含药血清+miR-NC 组为转染miR-NC 的H/R+含药血清组细胞；
H/R+含药血清+miR-148a 拮抗剂组为转染miR-148a 拮抗剂的H/R+含药血清组细胞；
与H/R+空白血清组比较，aP<0.01；
与H/R+含药血清+miR-NC 组比较，bP<0.01
3.4 DHS 通过miR-148a 调控TXNIP 表达降低自噬和凋亡水平 与H/R+空白血清组比较，H/R+含药血清组的TXNIP 表达下调；
而与H/R+含药血清+OENC 组比较，H/R+含药血清+TXNIP 过表达质粒组的TXNIP 表达显著上调。与H/R+空白血清组比较，H/R+含药血清组的自噬水平显著下降；
与H/R+含药血清+OE-NC 组比较，H/R+含药血清+TXNIP 过表达质粒组自噬水平显著上升。与H/R+空白血清组比较，H/R+含药血清组的H9c2 细胞活力升高（P<0.01），细胞凋亡减少；
与H/R+含药血清+OE-NC 组比较，H/R+含药血清+TXNIP 过表达质粒组的H9c2 细胞活力降低（P<0.05），细胞凋亡增加。见表4，图4。
图4 DHS 通过miR-148a 调控TXNIP 表达降低自噬和凋亡水平
表4 各组H9c2 细胞活力比较（%，）
表4 各组H9c2 细胞活力比较（%，）
注：H/R+空白血清组为大鼠空白血清处理H/R 组细胞；
H/R+含药血清+OE-NC 组为转染OE-NC 的H/R+含药血清组细胞；
H/R+含药血清+TXNIP 过表达质粒组为转染TXNIP 过表达质粒的H/R+含药血清组细胞；
H/R 为缺氧/复氧；
TXNIP 为硫氧还蛋白互作蛋白；
与H/R+空白血清组比较，aP<0.01；
与H/R+含药血清+OE-NC 组比较，bP<0.05
心肌缺血再灌注损伤通常是心肌缺血后供血恢复而诱发的细胞损伤，发病率呈逐年上升趋势[10]。有研究表明，瓜蒌对缺血缺氧心肌细胞具有保护作用[6]。同时，与DHS 主要成分相同的瓜蒌薤白半夏汤对缺血缺氧损伤的心肌细胞具有显著的保护作用[11]。本研究发现，DHS 能够降低体外H/R 细胞模型的细胞凋亡水平。
miRNA 与心血管疾病的发病有关，miR-146a 能够通过抑制NOX4 信号传导来防止心肌缺血再灌注损伤[12]。二甲双胍可调节miR-148a 来保护缺血/再灌注引起的氧化应激损伤[13]。DHS 主要成分瓜蒌和丹参通过调控miR-155 的表达来改善心脏疾病，瓜蒌薤白半夏汤可以通过调控miRNA 治疗冠心病[7，14]。本研究发现，miR-148a 在体外H/R 细胞模型中表达下调，进一步实验证实DHS 能够上调miR-148a 表达来降低体外H/R 细胞模型的细胞凋亡水平。
最后，本文在分析DHS 的作用机制上发现，DHS通过miR-148a 调控TXNIP 的表达来降低自噬水平进而缓解H/R 细胞损伤。已有研究表明，miRNA 通过抑制TXNIP 介导的心肌细胞焦亡来减轻大鼠心肌损伤[15]。更有证据表明，miR-148a 能够通过抑制TXNIP 表达来改善心肌缺血再灌注损伤[9]。过度自噬能够引起心脏损伤和细胞死亡，而TXNIP 能够调节自噬从而在急性缺血再灌注损伤中发挥关键的作用[16]。DHS 主要成分瓜蒌和薤白可以调节自噬水平抑制动脉粥样硬化[17]。这些报道都验证了DHS 能通过miR-148a 调控TXNIP 的表达来降低自噬水平进而缓解心肌缺血再灌注损伤。
综上所述，DHS 通过调控miR-148a/TXNIP 降低心肌细胞的自噬和凋亡水平进而缓解心肌缺血再灌注损伤。
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