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王莹，刘芫汐，范晶，昝珂，杨建波，金红宇，马双成
中国食品药品检定研究院，北京 102629
何首乌Polygonum multiflorumThunb.为蓼科多年生草本植物，块根是其主要的药用部位，具有抗衰老、调血脂、抗癌、抗炎、促进免疫调节、保护神经等作用[1]。近年来，多次出现何首乌及其制品致肝损伤的报道，引起社会广泛关注[2-4]。为进一步了解何首乌药用安全情况，对市场收集的多批次何首乌药材及饮片进行农药残留测定。何首乌为多年生根类药材，分布于河南、贵州、云南、四川、广东等地，多为栽培品[5]。长期的种植栽培可能产生一定量的有机氯残留。前期，已有学者建立了何首乌中有机氯类农药测定方法，并对其进行检测[6-7]；
同时，有报道建立了何首乌中26 种有机磷的气相色谱-火焰光度检测器（GC-FPD）测定法[8]。但随着农药品种使用的不断扩大，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）自2015 年版开始收录气相色谱-质谱法（GC-MS/MS）及液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）对农药多残留进行测定。目前，何首乌中关于农药多残留的测定方法及筛查数据尚未见报道。本课题组通过调研并结合国家禁用农药名录等，筛选出100 种农药（113 种农药单体）作为检测指标，采用GC-MS/MS 对收集到的53 批何首乌进行测定。
1.1 样品
从市场及种植基地共收集何首乌样品53 批。其中，20 批收集于饮片市场，33 批收集于种植基地，有确定产地来源。53 批样品中包括10 批制品（Z1～Z10）和43 批生品（S1～S43），见表1。样品经中国食品药品检定研究院中药民族药检定所杨建波副研究员鉴定均为正品。
表1 何首乌样品信息
1.2 仪器
QP2040 型气相色谱-质谱仪（日本岛津公司）；
FA1004C FA/JA-C 型电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；
Z260A 型离心机（德国Hermble 公司）；
Hel-VAP Advantage ML/HB 型旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）；
AH30 型高速全自动匀浆仪（睿科仪器有限公司）；
HLB 固相萃取柱（安捷伦公司500 mg/6 mL）。
1.3 试药
D-山梨醇（纯度：99.5%，美国Sigma公司，批号：0001423711）；
D-核糖酸内酯（纯度：95.0%，上海源叶生物科技有限公司，批号：S26834）；
乙腈为色谱纯（赛默飞世尔科技有限公司）；
氯化钠（批号：20191206，国药集团化学试剂有限公司）；
水为屈臣氏蒸馏水。农药对照物质来源于中国食品药品检定研究院、中国计量科学院、德国Ehrenstorfer公司等。自行配制质量浓度为100 μg·mL-1（溶剂为乙腈）的单标储备溶液，-20 ℃密封避光保存。
2.1 测定条件
DM17ms 弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；
载气为高纯氦气；
流速为1.3 mL·min-1；
进样口温度为240 ℃；
高压不分流进样；
升温程序（初始温度60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160 ℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min，以20 ℃·min-1升至320 ℃，保持3 min）。电子轰击电离（EI）测定条件：70 eV，离子源温度为200 ℃，接口温度为250 ℃。GC-MS/MS 质谱测定条件见表2。
表2 何首乌中113种农药化合物的tR、定量离子、定性离子、r、方法定量限（LOQ）及回收率
续表2
续表2
2.2 溶液的制备
2.2.1 混合对照品溶液的制备 根据对照品质谱上的响应丰度值确定混合对照品溶液中该指标的质量浓度，乙腈定容，贮藏在-20 ℃冰箱中备用。100 种农药中包括19 种禁用农药，其中禁用农药在混合对照品溶液中质量浓度为100～1000 ng·mL-1，其余农药在混合对照品溶液中质量浓度为500～1000 ng·mL-1。
2.2.2 分析保护剂的配制 取核糖酸内酯0.5 g，加乙腈25 mL 使溶解（A 液，20 mg·mL-1）；
另取山梨醇0.25 g，加水12.5 mL溶解，加乙腈至25 mL（B液，10 mg·mL-1）。A、B溶液合并，摇匀，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取供试品粉末5 g，置100 mL 试管中，加氯化钠1 g，精密加入乙腈50 mL，12 000 r·min-1匀浆处理3 min，3500 r·min-1离心10 min（离心半径为93 mm），分取上清液，沉淀加乙腈40 mL，匀浆2 min，3500 r·min-1离心10 min（离心半径为93 mm），合并2次提取的上清液，50 ℃减压浓缩至3～5 mL，用乙腈转移并定容至25 mL 量瓶中，摇匀，即得。
2.2.4 空白基质溶液的制备 取空白样品粉末约5 g，精密称定，置100 mL 试管中，按2.2.3 项下方法制备空白基质溶液。
2.2.5 基质混合对照品溶液的制备 分别精密量取混合对照品溶液适量，加空白基质溶液制成含各对照品为不同浓度系列的基质匹配混合对照品溶液（以甲基对硫磷记，质量浓度梯度为2、4、10、30、40 μg·L-1）。
2.3 样品测定
分别精密量取各质量浓度基质混合对照品溶液及供试品溶液各1.0 mL，精密加入分析保护剂溶液0.3 mL，混匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤。精密吸取上述溶液各1 μL 注入GC-MS/MS 测定。按标准曲线法计算供试品中100 种农药残留量，基质匹配混合对照品的GC-MS/MS测定总离子流图见图1。
图1 GC-MS/MS测定何首乌空白基质匹配的100种农药总离子流图
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线与定量限 取不同质量浓度的基质混合对照品溶液，注入仪器，以各成分的质量浓度为横坐标（X）、各成分峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果表明，各农药对照品线性r均大于0.991。表明线性关系良好。取混合对照品溶液，梯度稀释后按2.3 项下方法进样测定，以相关定量离子信噪比（S/N）为10∶1 时的质量浓度为仪器定量限，根据供试品溶液质量浓度计算方法定量限，结果见表2。
2.4.2 回收率和重现性试验 取何首乌空白样品粉末5 g，加入适量的混合对照品溶液，按2.2、2.3项下方法制备供试品溶液并测定。如表2 所示，平均加样回收率为70.4%～107.4%（以甲基对硫磷为例，添加水平为0.02 mg·kg-1），RSD均小于11.40%，符合农药残留测定要求。
2.5 测定结果
对53 批何首乌中的100 种农药进行了筛查，上述100种农药均未检出。
3.1 农药参数的选择
自《中国药典》2020 年版执行以来，在“0212药材和饮片检定通则”中增加了植物源性药材及饮片中33 种禁用农药的限度规定[9]，在“2341 农药残留量测定法”中主要采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS对这些参数进行测定。本研究在进行参数选择时，首先选择了大部分可用GC-MS/MS 测定的禁用农药，对何首乌中是否存在高风险农药进行筛查；
其次，通过查阅文献拟定了中药中常用的农药，尤其是针对何首乌栽培过程中可能存在的农药残留（如检测参数中包括20 余种有机氯类农药，主要是因为何首乌多在3～4 年后收获块根，若土壤中存在不易降解的有机氯类农药，可能会对药材造成污染）。前期已有报道发现，在人参[10]、三七[11]中多存在六六六、滴滴涕等农药，而在20世纪90年代，此类农药在我国已明令禁止使用，药材中检出主要源于土壤污染。在何首乌中农药残留研究的初期报道中，亦在多批次何首乌中检出六六六、滴滴涕及五氯硝基苯等农药[6-7]。此外，通过查阅相关书籍，总结出何首乌病虫害主要包括叶斑病、轮纹病、异色柱萤叶甲、茶黄蓟马等，防治病害时多用甲基托布津、多菌灵、百菌清及代森锰锌等喷射植株；
防治虫害多用氯氰菊酯、溴氰菊酯、吡虫啉等农药[12-13]。在本方法检测参数中亦包括了百菌清、氯氰菊酯、溴氰菊酯等GC-MS/MS可测定的参数。
3.2 前处理的选择
对何首乌生品及制品的前处理条进行了考察和优化，包括乙腈高速匀浆直接提取及提取后采用HLB 柱进行净化。从回收率结果来看，3 种净化方法回收率均为60%～120%，符合实验要求。何首乌为块根，基质较为简单，本研究采用直接提取法基本可满足分析要求。此法操作简便、成本低、提高了农药分析的效率。但值得注意的是，采用此法进行多批次样品检测时，仪器端流入成分增加，可能会对仪器造成一定污染，故在实验过程中应注意仪器的维护保养。建议根据观察基质标液的响应值变化推测进样口端及仪器的状态，从而进行有效维护。
3.3 分析保护剂的使用
基质效应（matrix effect）广泛存在于农药残留测定中，是指样品中目标分析物以外的组分对目标分析物分析过程的离子化产生的抑制与增强作用[14]，极大地影响了实验结果的准确性。采用GC-MS/MS进行农药残留检测时基质效应会增强。目前，改善基质效应的主要方法有空白基质匹配标准溶液、样品净化、同位素内标、分析保护剂、标准加入法等[15]。《中国药典》2020年版“2341农药残留量测定法”中主要采用空白基质匹配法校正基质效应[9]，本研究亦采用此方法对农药残留量进行定量分析。但在进行基质匹配时发现，部分农药色谱峰仍存在峰拖尾、响应值不高的问题，故本方法测定时在样品和对照品中同时加入了分析保护剂以改善峰形、提高农药的灵敏度。
分析保护剂为Erney等[16]于1993年首次提出，是一种模仿基质保护作用的单一化合物或简单混合物。其原理是在溶剂标准溶液和样品溶液中加入保护剂后，可以同等程度地补偿两者的基质效应，进而提高定量的准确性。本课题组于2010 年通过对多种潜力化合物的考察，最终选择以核糖酸内酯和山梨醇组合作为农药GC-MS-MS 测定的分析保护剂，并首次将其应用于中药农药残留测定中[17]。近年来，此分析保护剂组合也在其他品种中药的农药残留测定中得到广泛应用，验证了其有效性。例如，在陈皮[18]、白茅根[19]、当归[20]、麦冬[21]中的农药多残留GCMS/MS测定中，均采用分析保护剂以提高定量准确性。本研究结果亦证明，在加入分析保护剂后，特丁硫磷、水胺硫磷、甲草胺和丁草胺等峰形得到明显改善。
本研究建立的方法适用于何首乌（生品和制品）中100 种农药残留的GC-MS/MS 检测，对何首乌中农药监测有一定参考价值。同时，采用此方法完成了53 批何首乌中农药残留筛查，样品代表性较好，反映了不同产地、生制品何首乌中农药污染真实情况。通过测定发现，53 批样品中均未检出此100 种农药，初步表明何首乌中农药残留带来的药用风险性较小，对进一步了解何首乌药用安全提供了充分数据。
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