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王茹 钟桂兰 王小花 林芳婷 吴清瑜
(海南省妇幼保健院(海南省妇女儿童医学中心)妇科，海南 海口 570000)
卵巢癌尽管外科手术和放化疗等治疗手段使患者的生存时间有所延长，但卵巢癌患者5年总生存率不超过30%〔1〕。卵巢上皮癌是卵巢癌最常见的病理类型，其发生发展机制十分复杂，与多种基因的异常表达密切相关〔2～4〕。研究发现细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)3在卵巢癌中异常低表达，且其表达改变与患者预后不良有关〔5〕；
然而，SOCS3在卵巢癌发生发展中的作用并不清楚。本研究分析SOCS3在卵巢上皮癌细胞中的表达及其对癌细胞增殖和凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。
1.1实验细胞 人正常卵巢上皮细胞系IOSE-80(货号：MZ-2207)购于宁波明舟生物公司；
卵巢上皮癌细胞系SKOV-3(货号：GD-C3220384)、OVCAR-3(货号：FS-0329)和HO8910(货号：XY-XB-1086)购于美国ATCC。
1.2主要试剂及仪器 RPMI1640培养基(货号：C22400500BT)、McCoy 5A培养基(货号：16600-082)和0.25%胰蛋白酶(货号：25200-056)购于美国Gibco公司；
胎牛血清(货号：F8245-100)购于上海索莱宝生物科技有限公司；
四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂(货号：M2128-1G)和二甲基亚砜(货号：D8418-50ML)购于美国Sigma-Aldrich公司；
二奎啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(货号：P0009)和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(货号：C1062L)购于上海碧云天公司；
逆转录试剂盒(货号：4366596)购于杭州沃森生物公司；
Trizol试剂(货号：15596026)和脂质体2000(Lipofectamine2000)(货号：11668-027)购于美国Invitrogen公司；
SOCS3抗体(货号：ab14939)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号：ab8245)和白细胞介素(IL)-6抗体(货号：ab9324)购于美国Abcam公司；
信号转导和转录激活因子(STAT)3抗体(货号sc-8019)和磷酸化(p)-STAT3抗体(货号：sc-8059)购于美国Santa cruz biotechnology公司；
辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG二抗(货号：KN10097)购于上海研卉生物科技有限公司；
pcDNA3.1-SOCS3过表达载体及pcDNA3.1空载体由上海吉凯基因公司构建完成；
Gel Doc XR型凝胶成像分析系统和CFX96型荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad公司；
Multiskan FC型酶标仪购于美国Thermo公司；
FACSCalibur型流式细胞仪购于美国BD公司。
1.3细胞培养 SKOV-3细胞采用含10%胎牛血清的McCoy 5A培养基培养，IOSE-80、OVCAR-3和HO8910细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，细胞均在5%CO2、37℃和湿度饱和的细胞培养箱内培养。每2 d换液1次，3 d传代1次，选取长势良好的第3～5代对数生长期细胞进行实验。
1.4实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SOCS3 mRNA表达 采用Trizol法提取IOSE-80、OVCAR-3、HO8910和SKOV-3细胞总RNA后，参照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录合成cDNA，再取2 μl cDNA为模板，与12.5 μl SYBR Premix Ex Taq、1 μl上游引物、1 μl下游引物和8.5 μl H2O2配制成总体积为25 μl的反应体系，将其放置荧光定量PCR仪上后，按照设定的反应程序(95℃预变性5 min；
95℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35个循环)进行扩增。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算IOSE-80、OVCAR-3、HO8910和SKOV-3细胞中SOCS3 mRNA表达。其中，由上海生工生物合成的PCR引物序列如下：SOCS3上游引物：5′-CCAAGAACCTACGCATCAA-3′，下游：5′-GGAGTCCAGGTGACCGTTG-3′；
GAPDH上游引物：5′-GGTC TCCTCTGACTTCAACA-3′，下游：5′-AGCCAAATTCG TTGTCATAC-3′。
1.5细胞分组与转染 实验分为对照组(未处理)、空载体组(转染pcDNA3.1空载体)和SOCS3组(转染pcDNA3.1-SOCS3过表达载体)。将对数生长期的SKOV-3细胞按照每孔2×105个接种至6孔细胞板上，置于5%CO2、37℃和湿度饱和的培养箱内培养。待细胞融合度达70%时，参照Lipofectamine2000说明书步骤将pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-SOCS3过表达载体转染至SKOV-3细胞中。转染6 h后，更换新鲜培养液继续培养48 h。收集各组细胞，采用qRT-PCR法和Western印迹法检测各组细胞中SOCS3 mRNA和蛋白表达以评价转染效果。
1.6MTT法检测细胞增殖 将转染后的SOCS3组、空载体组和正常培养的对照组SKOV-3细胞按照每孔105个接种至96孔细胞板上，其中每组设置3个平行孔，置于5%CO2、37℃和湿度饱和的环境下培养24、48、72和96 h后，弃培养液；
每孔加入浓度为5 mg/ml MTT试剂20 μl；
孵育4 h后，弃培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜；
震荡反应15 min后，上酶标仪在490 nm处检查各组细胞的细胞光密度(OD)。实验重复3次。
1.7流式细胞仪检测细胞凋亡 胰蛋白酶消化收集转染48 h后SOCS3组、空载体组和正常培养对照组细胞，以磷酸缓冲液制成浓度为106个/ml细胞悬液。取细胞悬液1 ml置于离心管中，以1 000 r/min在4℃下离心5 min后，弃上清液；
加入200 μl结合缓冲液悬浮细胞后，依次加入各5 μl膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)和碘化丙啶(PI)，充分混匀后避光环境下反应20 min。补加300 μl结合缓冲液后，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。实验重复3次。
1.8Western印迹检测SOCS3、IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白表达 向IOSE-80、OVCAR-3、HO8910或SKOV-3细胞中加入细胞裂解液抽提细胞总蛋白后，参照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白的浓度与纯度。将变性后的蛋白样品按照每孔60 μg上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，其中每个样品设置3个复孔。行电泳分离后，将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上。以5%脱脂奶粉封闭60 min后，洗膜缓冲液洗膜5 min×3次。加入SOCS3(1∶500)、IL-6(1∶500)、STAT3(1∶200)、p-STAT3(1∶200)和GAPDH(1∶1 000)抗体4℃孵育过夜。洗膜后，加入相应二抗(1∶2 000)室温孵育2 h。再次洗膜后，加入化学发光剂在暗室内显影曝光。采用凝胶成像分析系统扫描分析。实验重复3次。
1.9统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行单因素方差分析，SNK-q检验。
2.1SOCS3在卵巢上皮癌细胞中表达水平 与人正常卵巢上皮细胞系IOSE-80相比，卵巢上皮癌细胞系SKOV-3、OVCAR-3和HO8910中SOCS3 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05)，其中SKOV-3细胞中SOCS3 mRNA和蛋白表达最低。故后续以SKOV-3细胞进行实验。见图1和表1。
表1 各细胞系中SOCS3 mRNA和蛋白表达比较
图1 Western印迹检测各细胞系SOCS3蛋白表达
2.2转染后卵巢上皮癌细胞中SOCS3表达水平 与对照组比较，空载体组细胞中SOCS3 mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)；
而SOCS3组细胞中SOCS3 mRNA和蛋白表达较对照组、空载体组均明显升高(P<0.05)。见图2和表2。
图2 Western印迹检测SOCS3蛋白表达
2.3SOCS3过表达对卵巢上皮癌细胞增殖的影响 转染24、48、72和96 h后空载体组细胞增殖活力与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；
转染48、72和96 h后SOCS3组细胞增殖活力较对照组、空载体组均明显降低(P<0.05)。见表2。
表2 各组细胞SOCS3 mRNA和蛋白表达、转染不同时间细胞增殖活力、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表达比较
2.4SOCS3过表达对卵巢上皮癌细胞凋亡的影响 对照组、空载体组和SOCS3组细胞凋亡率分别为(3.25±0.26)%，(3.78±0.30)%和(13.01±0.56)%，各组细胞凋亡率存在明显差异(F=541.040，P<0.001)。与对照组比较，空载体组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；
但SOCS3组细胞凋亡率较对照组、空载体组明显升高(P<0.05)。见图3。
图3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡
2.5SOCS3过表达对卵巢上皮癌细胞中IL-6/STAT3信号通路的影响 与对照组比较，空载体组细胞中IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)；
与对照组、空载体组比较，SOCS3组细胞中IL-6和p-STAT3蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。见表2和图4。
图4 Western印迹检测各组细胞中IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表达
卵巢癌具有发病隐匿和进程快等特点，多数患者确诊时已为晚期，错失了手术治疗的最佳时期，而以铂类为主的化疗效果并不理想〔6～8〕。随着科技的不断发展及精准医疗的提出，分子靶向治疗使卵巢癌患者的治疗趋于个体化和精准化〔9〕。因此，寻找新的、有效的治疗靶点一直是近年来卵巢癌研究的热点。
SOCS3是SOCS家族成员，定位于17q25.3染色体上，由675个氨基酸组成；
该基因启动子上存在能够与STAT3的结合位点，可负向调控STAT3介导的信号通路〔10〕。Li等〔11〕研究发现，SOCS3在肺癌组织中呈现低表达，可被miR-410靶向调控，且在miR-410低表达抑制A549细胞增殖和促进细胞凋亡过程中发挥着积极作用。洪洙等〔12〕报道指出，SOCS3在结肠癌中表达下调，而上调其表达可通过甲基化作用抑制SW480细胞增殖和侵袭，SOCS3被认为是结肠癌治疗的潜在靶点。马张婧等〔13〕在乳腺癌中发现，诱导SOCS3表达可通过对转录因子STAT3的负反馈作用抑制癌细胞增殖并促进细胞凋亡。本研究结果表明，SOCS3过表达可抑制卵巢癌SKOV-3细胞增殖并促进细胞凋亡。提示SOCS3可通过调控癌细胞增殖和凋亡在卵巢上皮癌发生发展过程中发挥着重要的抑癌作用。
IL-6是一种可由多种细胞产生的多功能因子，它不仅可诱导一系列炎性因子的表达，还可通过激活STAT3通路参与细胞增殖和凋亡，与卵巢上皮癌细胞的发生发展密切相关，阻断IL-6/STAT3通路可能是治疗卵巢上皮癌的重要策略〔14～16〕。通常情况下，SOCS3在细胞中呈低表达或不表达状态；
当受到某些炎症因子如IL-6刺激时，SOCS3表达水平明显升高〔17〕；
而SOCS3表达升高又可抑制IL-6介导的信号通路〔12〕。张婷等〔18〕研究发现，在神经病理性疼痛小鼠模型中SOCS3过表达可抑制胶质细胞中促炎因子IL-6的表达。Tu等〔19〕在五加仑葡萄糖抗狂犬病病毒实验中及黄玲玲等〔20〕在儿童急性淋巴细胞白血病研究中证实SOCS3过表达可抑制STAT3通路的活化。本研究结果表明，SOCS3过表达可抑制卵巢上皮癌SKOV-3细胞中IL-6/STAT3通路的活化。提示，SOCS3可能通过介导IL-6/STAT3通路参与卵巢上皮癌细胞增殖和凋亡。
