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石乙欣，冯耀元，邢晓娅，刘宣辰，练旭冬，毛莹莹，韩英浩，金美华
（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）
糖尿病目前是严重危害人类健康的慢性疾病之一，假如不能及时进行治疗，可发展成心、脑、肾等多器官并发症，严重危害人们健康[1]。胰岛素治疗存在不可控性，无法随时根据患者的身体状态做出调整，还有可能影响患者身体状态，造成损伤[2]。据估计，到2035年，全球糖尿病患者数量将超过5.5亿人[3]。因此，研究出经济实惠且有降血糖的药物迫在眉睫。
糖尿病的发病原理主要包括三个方面，首先是根本上胰岛素量的不足，不能够有效控制血糖。再就是受体细胞对胰岛素识别能力差，胰岛素无法有效调控。第三是胰岛素自身结构缺陷，从而引起的代谢失衡。该病会导致无法及时进行糖代谢，临床症状表现为三多一少[4]。糖尿病会影响组织器官正常工作，形态学结构也会发生病变，并伴随一系列并发症，威胁糖尿病患者的健康。目前糖尿病治疗局限在药物治疗、饮食与运动稳定控制。治疗仍有很大的局限性。在饮食和运动方面治疗更多的是维持现状，不能有效治疗，并且存在不稳定性。重度糖尿病患者往往只能通过胰岛素注射缓解病情，也仅仅是能够维持，注射胰岛素会导致患者低血糖、组织水肿、过敏等不良反应，而且糖尿病人在治疗的过程中也会遭受痛苦的折磨。目前，糖尿病不仅影响着发达国家的经济还给社会带来一定负担，而同时给作为如中国、印度等的发展中国家的社会发展和经济建设等方面制造了难题和挑战。
在探索研究糖尿病的过程中，发现或合成了许多能够治疗糖尿病的药物，但是各有局限性[5]。在胰岛素探索的道路上从人工胰岛素到重组胰岛素，再到胰岛素类似物，胰岛素相关技术不断突破。胰岛素可以靶向外周相关组织代谢活动从而调控葡萄糖水平[6]，能够直接有效的控制机体血糖，但患者在自行注射胰岛素过程中会发生用量过高导致低血糖的症状发生。不仅如此，目前市面上治疗糖尿病的药物或多或少都会都人体造成损害，磺脲类药物就是其中之一，例如；
格列吡嗪和格列本脲就是其中的典型药物，其能够提高胰岛素分泌水平，长期使用磺脲类药物会引起患者溶血性贫血等疾病；
双胍类药物是另外一种公认的药物类型，其作用机理是提高葡萄糖在人体的分解速率，降底葡萄糖利用率，还可以提高葡萄糖敏感度，加速糖代谢，长期使用该类药物会对胃肠以及血小板造成损伤[7]。因此，通过研究一种天然药物来加强糖尿病的治疗作用，已成为糖尿病研究的一个重要领域，并会受到世界各国医学界的普遍关注[8]。冬瓜皮作为中国传统中药[9]，其提取物中含有游离芳香化合物和糖基芳香化合物[10]，可能对糖尿病有治疗效果。
因此，研究采用129/SVJ野生型小鼠为研究对象，利用链脲佐菌素建立糖尿病模型[11]，冬瓜皮提取物灌胃治疗，制作病理组织切片，并采用H&E染色探究冬瓜皮提取物的降糖效果以及对胰腺、肝脏、肾脏形态学结构影响[12]，初步探讨冬瓜皮提取物对糖尿病的治疗效果，为探究冬瓜皮提取物治疗糖尿病具体机理提供理论基础。
1.1 材料
1.1.1 实验动物
试验动物为SPF级野生型（WT）129/SvJ小鼠24只雌雄各半，每笼三只小鼠，自由采食饮水，12 h光周期饲养，湿度维持在50%~60%。
1.1.2 主要试剂
冬瓜皮提取物；
链脲佐菌素（Solarbio）；
苏木色精（阿拉丁生化公司）；
伊红Y（阿拉丁生化公司）；
氨水（天津基准化学试剂）；
无水乙醇（泉瑞试剂公司）；
冰乙酸（天津基准化学试剂）；
石蜡（德国莱卡公司）；
10%中性福尔马林（Solarbio）；
中性树胶（上海懿洋仪器公司）；
二甲苯（泉瑞试剂公司）；
盖玻片、载玻片（世泰公司）。
1.2 方法
1.2.1 构建糖尿病小鼠模型
将24只小鼠适应性饲养3 d，随机取6只作为对照组，其余18只构建STZ糖尿病小鼠模型，断粮12 h（不断水），称量并记录空腹小鼠体重。造模组向小鼠腹腔内注射1%链脲佐菌素溶液，（200 mg·L-1，使用pH4.5的柠檬酸缓冲液配制），对照组腹腔注入相同体积的0.9%氯化钠注射液。尾尖采血检测注射后第5天禁食12 h（不禁水）的小鼠空腹血糖值，糖尿病小鼠空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1视为造模成功，可用于后续实验。
1.2.2 进行冬瓜皮提取物治疗
将造模成功的小鼠随机分配，分为为糖尿病模型组和冬瓜皮提取物治疗组（每组各6只小鼠），冬瓜皮提取物治疗组每天灌胃给药（浓度：400 mg·L-1）1 mL，空白对照组和实验对照组灌胃同等体积的纯净水，连续给药4周，每日观察小鼠外观并记录各组饮水量和饮食量，每三天记录小鼠血糖值和体重。
1.2.3 葡萄糖耐受实验
冬瓜皮提取物治疗四周结束后，将小鼠禁食12 h，尾尖采血测量小鼠空腹血糖值，将所测得结果记为0 min，再通过腹腔注射葡萄糖溶液（2 g·L-1，0.9%生理盐水）100 μL提高小鼠血糖浓度，在腹腔注射葡萄糖溶液后30 min至120 min时（每隔30 min）尾尖采血测量小鼠血糖值，观察小鼠葡萄糖耐受能力变化。
1.2.4 小鼠胰岛、肝脏和肾脏组织H&E染色
将小鼠处死后，使用生理盐水心脏灌流，排出组织中存留血液，避免影响实验结果，取出胰腺、肝脏、肾脏，生理盐水冲洗，福尔马林固定24 h。固定结束后，从福尔马林中取出，对组织进行修整，将剖面向上放入包埋盒中并放进玻璃缸中流水冲洗1.5 h。冲洗结束后，用脱水机进行常规脱水，脱水结束后进行石蜡包埋，-20℃冷冻台加速石蜡凝固，包埋结束后放入-20℃冰箱冷冻24 h。冷冻结束后进行切片，将蜡块切成5 μm薄片，在摊片机中将薄片摊平，用载玻片挑起石蜡组织薄片，自然晾干4~6 h，晾干后进行常规H&E染色，自然晾干12 h。最后在多功能显微镜下观察切片并采集照片[13]。
1.2.5 统计学处理
2.1 构建糖尿病小鼠模型
研究利用腹腔内注射链脲佐菌素诱导构建小鼠糖尿病模型，由表1数据可看出，在注射STZ溶液后禁食的五天所测得的血糖值，模型组的血糖值均高于对照组的血糖值，血糖值有上升趋势，在禁食的3、4、5 d所测得的血糖值均≥11.1 mmol·L-1，糖尿病小鼠模型造模成功，可用于后续实验。
表1 葡萄糖对糖尿病小鼠模型的构建情况Table 1 Construction of glucose on diabetic mouse model
2.2 冬瓜皮提取物对血糖的影响
从表2中可以看出冬瓜皮提取物治疗3 d就起到了降糖效果，干预12 d后，对照组血糖持续升高，冬瓜皮提取物治疗组小鼠血糖维持较稳定，且从图1中可以看出对照组和冬瓜皮提取物治疗组的血糖值的变化差异。说明冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠有很好的降糖效果
表2 冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠血糖水平的影响Table 2 Effect of wax gourd peel extract on blood glucose level of diabetic mice
图1 对照组和冬瓜皮提取物治疗组血糖变化散点图Fig.1 Blood glucose changes in the control group and wax gourd skin extract treatment groups
2.3 小鼠的葡萄糖耐受实验
由表3和图2表现，在给药4周后，小鼠禁食12 h，腹腔注入葡萄糖溶液（2 g·L-1，0.9%生理盐水）100 μL时，30 min时差异最为显著，可以明显看出冬瓜皮提取物对小鼠葡萄糖耐受能力的提高。随着时间延长60 min处差异缩小，90 min时两组数值十分接近，说明冬瓜皮提取物治疗后，相较于实验对照组，冬瓜皮治疗组葡萄糖耐受能力明显提高，在30 min处最为显著。说明冬瓜皮提取物治疗后小鼠的糖耐受能力提高。
表3 冬瓜皮提取物对小鼠糖耐量的影响Table 3 Effect of wax gourd peel extract on glucose tolerance in mice
图2 小鼠葡萄糖耐受曲线Fig.2 A glucose tolerance curve in mice
2.4 冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠胰腺的组织病理学的影响
胰腺H&E染色观察结果如图3所示，空白对照组的胰岛胞浆饱满、体积大、边界清晰、形状规则，胰岛内细胞饱满，大小均匀[14]；
实验模型组小鼠的胰岛数量明显减少，形态不规则细胞排列紊乱，并且胰岛体积减小，血管轻度增生；
冬瓜皮提取物治疗组小鼠胰岛体积较模型组增大，其胰岛内细胞大小更加均匀，排列较为有序，胞浆较为饱满，有逐渐恢复正常的趋势。说明冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠胰腺有显著修复效果，对糖尿病小鼠有治疗效果。
图3 冬瓜皮提取物对小鼠胰腺组织病理学的影响Fig.3 Effects of wax gourd skin extract on pancreatic histopathology in mice
2.5 冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠肝脏的组织病理学的影响
各组小鼠的肝脏H&E的染色结果如图4所示。空白对照组小鼠的肝脏仍然保持索状结构，并且肝细胞饱满[15]；
糖尿病模型组的小鼠并未观察到肝脏索状结构，其肝细胞出现了不同程度的肿胀和空泡；
冬瓜皮治疗组小鼠索状结构开始恢复，细胞较为饱满，细胞排列紧密，空泡较实验对照组较少。说明冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠的肝脏也具有治疗修复效果，能够改善糖尿病带来的肝脏损伤。
2.6 冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠肾脏的组织病理学的影响
各组小鼠的肾脏H&E的染色结果如图5所示。空白对照组的肾小球和肾小管规则并排列整齐，肾小球中没有出现毛细血管基底膜或基质的增生现象以及肾小球肥大现象，同时也没有出现变性、坏死以及纤维化的现象；
肾小管结构也比较的完整，间质内没有充血以及炎性细胞的浸润；
肾髓质集合管结构完整，并且无变性、坏死和脱落的现象[16]。而糖尿病模型组的肾小球发生了萎缩，肾小管上皮细胞变性坏死以及纤维化，肾小管呈蛋白管型，间质有炎性细胞浸润。冬瓜皮提取物治疗组的肾组织病理损伤与糖尿病治疗组相比肾小球、肾小管排列较为整齐，变性坏死现象有所改善，毛细血管基底膜或基质增生以及肾小球肥大有所减少。
图4 冬瓜皮提取物对小鼠肝脏组织病理学的影响Fig.4 Effects of wax gourd skin extract on liver histopathology in mice
图5 冬瓜皮提取物对小鼠肾脏组织病理学的影响Fig.5 Effects of wax gourd skin extract on renal histopathology in mice
糖尿病及并发症属于人体复杂性、综合性、多系统性代谢性慢病，胰岛素缺乏本质上是胰腺胰岛B细胞代谢障碍所致的。即属于内分泌系统胰腺器官胰岛细胞自身代谢中氨基酸合成转化为激素（胰岛素、胰高血糖素等）途径发生了障碍[17-18]。胰岛素作用的靶向器官是肝脏，胰岛素抵抗是2型糖尿病患者的主要发病原因[13]。糖尿病还能够诱发肾脏并发症，糖尿病性肾损伤也经常会伴随糖尿病出现[19]。所以在探究糖尿病的过程中，胰腺、肝脏、肾脏的变化以及内在机理值得深入探究。STZ作为糖尿病动物模型常用诱导剂，药物在损害胰腺的同时能够造成肝损伤[20-21]。
通过对小鼠胰腺、肝、肾的HE染色过程，发现冬瓜皮提取物能够有效的改善因STZ诱导糖尿病所造成的各种组织损伤，例如细胞数量增多排列紧密，索状结构等功能性结构明显恢复。可以说明，冬瓜皮提取物可以有效修复治疗STZ诱导模型小鼠胰腺、肾脏、肝脏形态学以及功能性损伤，有效地恢复各个器官的功能，对糖尿病的治疗有极大的帮助。并且冬瓜皮提取物在治疗的第3天就可以降低小鼠血糖恢复到正常水平并维持相对稳定，并且能够提高葡萄糖耐受量，可以说明冬瓜皮提取物对糖尿病的治疗作用，为糖尿病人的治疗提供一种新的可能。同时冬瓜皮也是一味传统中药，“味甘，性凉，无毒”这是《本草再新》中对冬瓜皮的描述，研究也能够为传统中医治疗糖尿病提供新的思路。
研究仅对冬瓜皮提取物进行研究，治疗效果十分明显，但是具体有效成分以及作用机制尚不清楚，对有效成分的探究可能进一步提高治疗效果，在查阅论文中发现冬瓜皮中的多糖、黄酮、多酚类物质有较大的可能是治疗糖尿病的有效物质[23]，希望未来能够发现冬瓜皮提取物治疗糖尿病的有效成分。
研究结果为冬瓜皮提取物对糖尿病小鼠治疗效果和糖耐量以及相关组织器官修复作用的初探，对于胰岛素耐量、毒副作用以及相关信号通路等将会在后续研究中做出针对性开展。
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