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韩敏敏 ，高程海，米顺利，陈显强，薛命雄，梁振秀，唐振洲 ，张 玲，*
（1.广西中医药大学中医药科学实验中心，广西 南宁 530200；
2.广西中医药大学海洋药物研究院，广西 南宁 530200；
3.广西北海生巴达生物科技有限公司，广西 北海 536000）
钝顶螺旋藻（spirulina platensis）是一种多细胞丝状螺旋形海洋藻类生物，富含藻蓝蛋白（C-phycocyanin，C-PC）、多糖、β-胡萝卜素等生物活性成分。其中，藻蓝蛋白是螺旋藻中一种主要功能性蛋白质，占螺旋藻（干基）的20%［1］，是一种在光激发下能产生活性氧从而进行光动力治疗的光敏剂［2］，具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗炎、保护肝脏等药理活性，有极大开发成药物的潜力［3-5］。
光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是治疗肿瘤的有效手段之一，PDT 治疗可导致肿瘤细胞死亡和凋亡，并损伤肿瘤相关血管。近年来，PDT 的作用机制越来越受到关注。肿瘤细胞的免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要因素［6-7］。目前，已有多项相关研究证实藻蓝蛋白联合光动力疗法治疗实体瘤取得了不错的治疗效果［8-10］。本研究从机体免疫调节功能的角度探讨藻蓝蛋白联合光动力疗法对人胰腺癌细胞的体内抗肿瘤作用，为开发研制抗肿瘤药物以及将藻蓝蛋白作为光敏剂开发应用于临床癌症疾病治疗提供一定的实验依据。
1.1 动物 SPF级BALBC/C裸鼠，40只，雌雄各半，体质量18～20 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004；
质量合格证号：430727201101851386。无菌环境饲养。
1.2 细胞株 人胰腺癌细胞SW1990 购于中国科学院昆明动物研究所。
1.3 试药与试剂 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白冻干粉，纯度为A620/A280≥3.5，购自宁波宾美生物科技公司，密封阴凉干燥避光处保存，使用前用灭菌蒸馏水配制成所需浓度；
注射用环磷酰胺（cyclophosphamide for Injection，CY，江苏盛迪医药有限公司产品）购于广西中医药大学附属瑞康医院，每瓶0.2 g，储藏温度不超过25 ℃，使用前用灭菌生理盐水配制成所需浓度；
不完全Leibovitz’s L-15 培养基（货号：KGM41300N，江苏凯基生物技术股份有限公司）；
0.25 % Trypsin-EDTA（1×）（货号：2120734，Gibco 公司）；
青链霉素混合液（货号：2257222，Gibco 公司）；
胎牛血清（货号：2068801CP，Gibco 公司）；
小鼠白介素6（IL-6）酶联免疫试剂盒（货号：CSB-E04741m，武汉华美生物工程有限公司）；
小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫试剂盒（货号：CSB-E04639m，武汉华美生物工程有限公司）。
1.4 仪器 万分之一电子分析天平（型号：ML204T，广州梅特勒托利多公司）；
台式高速冷冻离心机（型号：CT15RE，日本日立有限公司）；
二氧化碳培养箱［型号：PHCbi MCO-170AICDL-PC，普和希健康医疗器械（上海）有限公司］；
生物安全柜（型号：HR1500-IIB2，青岛海尔特种电器有限公司）；
倒置生物显微镜（型号：CKX41，OLYMPUS）；
超低温冰箱（型号：DW-86L728J，青岛海尔特种电器有限公司）；
超纯水仪（型号：德国MERCKMILLIP ORE IQ7000，广西南宁市博美生物科技有限公司）；
数显恒温水浴锅（型号：HHS4，常州金坛良友仪器有限公司）；
组织研磨器（型号：2 ml，成都蜀牛科技有限公司）；
局部光动力治疗仪（型号：CG-2，广州市祥光中医癌症防治研究所研制）。
2.1 动物模型的建立 实验分为6 组：正常组、模型组、激光照射组、C-PC 组、C-PC+激光照射组、CY 组。正常组10 只，其他每组6 只。除正常组外，余组参考文献［11］的方法进行造模。取SW1990细胞用磷酸缓冲盐溶液（PBS）稀释至5×107/ml 的细胞悬液后，接种到裸鼠右前肢腋窝处，每只裸鼠接种0.2 ml，制成人胰腺癌裸鼠移植瘤模型，整个操作在30 min 内完成。无菌环境饲养，从第1 天开始每隔一天用数显游标卡尺测量一次肿瘤的长径（a）与横径（b），测量肿瘤直径长约0.5 cm左右时则造模成功。
2.2 治疗干预 正常组：不进行激光照射、不给药，予等体积饮用水；
模型组：不进行激光照射、不给药，予等体积饮用水；
激光照射组：采用局部光动力治疗仪照射种瘤区，光源距离鼠体瘤区30 cm，光源直径2 cm，每 次 15 min，连 续 照 射 2 周 ；
C-PC 组 ：予500 mg（/kg·d）藻蓝蛋白液灌胃给药，容积为20 ml/kg，连续给药2 周；
C-PC+激光照射组：予500 mg（/kg·d）藻蓝蛋白液灌胃给药2 h 后，用局部光动力治疗仪照射种瘤区，每次照射 15 min，连续 2 周；
CY 组：予40 mg（/kg·d）环磷酰胺腹腔注射给药，每隔一天腹腔注射给药1次，连续给药2周。
2.3 指标测定 从第1 天开始每隔一天用数显游标卡尺测量一次肿瘤的长径（a）与横径（b），同时称量小鼠体重。于末次给药24 h 后将全部小鼠称重，眼球采血后处死，置于75%消毒酒精溶液中浸泡5 min，无菌条件下解剖小鼠，取出脾脏，分离皮内与完整瘤块，将上述组织剥离、除去包膜，准确称量，计算脾指数、肿瘤体积及抑瘤率。公式如下：脾指数=脾脏质量/体质量（脾脏质量单位为mg，体质量单位为g）；
肿瘤体积=1/2×a×b（2a为长径，b为横径）；
抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-实验组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。
2.4 细胞因子的测定
2.4.1 小鼠血清中TNF-α 水平的测定 全血标本置于4 ℃冰箱中过夜后，于4 ℃低温离心机1 000 g 离心15 min，取上清液，置于-20 ℃保存，避免反复冻融。检测前血清标本需再次离心，取上清液，按照小鼠TNF-α酶联免疫试剂盒说明书测定TNF-α的含量。
2.4.2 小鼠脾脏细胞培养液中TNF-α水平的测定 用PBS 洗去脾脏组织上的结缔组织或脂肪，在60 mm2无菌培养皿中加入5 ml L15 完全培养基，用无菌注射器的扁平末端以温和画圆的方式研磨脾脏5 次，200 目筛网过滤至离心管中，300 g离心10 min，去上清液，用L15 完全培养液洗 3 次，细胞悬液浓度为 5×106/ml，置于二氧化碳细胞培养箱中培养24 h。收集细胞上清液，1 000 g离心10 min 去除颗粒和聚合物，取上清液，按照小鼠TNF-α 酶联免疫试剂盒说明书检测TNF-α活性。
2.4.3 小鼠血清中IL-6 水平的测定 全血标本置于4 ℃冰箱中过夜后，于4 ℃低温离心机1 000 g 离心15 min，取上清液，按照小鼠IL-6 酶联免疫试剂盒说明书测定血清中IL-6水平。
2.5 统计学方法 实验数据均采用Excel工作表进行数据整理，采用IBM SPSS Statistics 21 软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。
3.1 一般情况观察 正常组小鼠精神状态良好，皮肤光滑无粗糙皱缩现象；
模型组小鼠成瘤后，活动减少，精神萎靡倦怠，体重减轻，皮肤表面粗糙有褶皱；
CY组小鼠受化疗药物环磷酰胺的影响，精神倦怠，活动少，不活动时大多数背部呈“弓”字样蜷缩；
C-PC 组、激光照射组和C-PC+激光照射组的小鼠精神状态及活动较为活泼。动物成瘤率为100%，整个动物饲养实验过程中未出现小鼠死亡现象。
3.2 各组小鼠瘤重、瘤体积和抑瘤率比较 见表1、图1。结果显示，与模型组比较，C-PC 组瘤重显著减少（P＜0.05）；
CY组及C-PC+激光照射组瘤重和瘤体积均显著减少（P＜0.05 或P＜0.01）；
激光照射组对瘤重和瘤体积无显著影响。激光照射组、C-PC 组、C-PC+激光照射组的抑瘤率分别为（39.42±8.47）%、（42.85±12.15）%、（74.80±11.85）%，而C-PC+激光照射组的抑瘤率与CY组（78.58±8.87%）相当（P＞0.05）。
表1 各组小鼠瘤重、瘤体积和抑瘤率比较 （）
表1 各组小鼠瘤重、瘤体积和抑瘤率比较 （）
注：与模型组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；
与CY组比较，③P＜0.05
n抑瘤率（%）组 别正常组模型组CY组激光照射组C-PC组C-PC+激光照射组10— —78.58±8.87 39.42±8.47③42.85±12.15③74.80±11.85 6 6 6 6 6瘤重（g）—0.539±0.129 0.108±0.037②0.324±0.074 0.296±0.027①0.132±0.055②瘤体积（cm3）—0.703±0.286 0.138±0.057①0.412±0.094 0.383±0.086 0.158±0.090①
图1 各组小鼠肿瘤直观图
3.3 各组小鼠脾重、脾指数比较 见表2。与正常组比较，模型组的脾重和脾脏指数显著减少（P＜0.05）；
与模型组比较，激光照射组、C-PC 组和C-PC+激光照射组均能显著增加脾重和脾指数（P＜0.05 或P＜0.01），而CY 组小鼠脾重和脾指数显著下降（P＜0.05）。表明单独激光照射或藻蓝蛋白处理均有免疫增强的作用，二者联用效果更显著。
表2 各组小鼠脾重、脾指数比较 （）
表2 各组小鼠脾重、脾指数比较 （）
注：与正常组比较，①P＜0.05；
与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01
脾指数（%）10.280±1.229 9.818±0.363①7.373±1.031②12.68±0.538②13.56±1.192③15.59±1.038③组 别正常组模型组CY组激光照射组C-PC组C-PC+激光照射组n 10 6 6 6 6 6脾重（g）0.207±0.020 0.188±0.020①0.132±0.052②0.256±0.033③0.297±0.041③0.361±0.055③
3.4 各组小鼠TNF-α 及IL-6 水平比较 见表3。与正常组比较，模型组TNF-α 及IL-6 水平无显著性差异（P＞0.05）；
与模型组比较，C-PC 组和C-PC+激光照射组均能显著增加小鼠TNF-α及IL-6的水平（P＜0.05或P＜0.01）；
而 CY 组 TNF-α 及 IL-6 的水平显著下降（P＜0.05 或P＜0.01）；
激光照射组可促进IL-6 含量（P＜0.05），而对TNF-α水平无显著影响（P＞0.05）。
表3 各组小鼠TNF-α及IL-6水平比较 （）
表3 各组小鼠TNF-α及IL-6水平比较 （）
注：与模型组比较，①P＜0.05，②P＜0.01
组 别n IL-6（pg/ml）21.79±6.20 14.27±3.21 5.15±2.92①39.17±9.38①34.73±9.76①51.43±14.34②正常组模型组CY组激光照射组C-PC组C-PC+激光照射组10 6 6 6 6 6 TNF-α（pg/ml）血清24.42±3.23 30.07±4.04 10.68±3.77②46.56±11.00 72.73±9.31②89.00±8.43②脾脏38.89±12.87 49.44±16.47 22.99±7.82①68.01±8.37 85.01±10.83②118.39±18.00②
胰腺癌（PDA）是一种恶性程度很高的消化系统肿瘤，发病率呈逐年上升趋势，且早期诊断率不高，是目前手术预后效果差的癌种之一［12-13］。
正常情况下，机体的免疫系统处于相互平衡的状态，当发生肿瘤时，机体免疫功能就会降低，平衡状态被破坏。因此，肿瘤的发生、发展与免疫系统有着密不可分的关系［14］。经证实，光动力疗法可以诱导特异性和非特异性免疫反应，从而提高光动力介导的抗肿瘤效果［15］，光动力治疗与抗肿瘤免疫治疗的联合应用具有显著的协同抗肿瘤效应［16-18］。
本实验采用裸鼠作为实验对象，在裸鼠的右前肢腋窝处皮下接种人胰腺癌SW1990 细胞，由于是人源肿瘤细胞异源接种在动物皮下部位，所以肿瘤潜伏生长周期较长，一般在7～14 d 左右才可以达到实验所需肿瘤体积，但成瘤率较好，高达100%。体内实验结果表明，激光照射、藻蓝蛋白处理以及藻蓝蛋白联合激光照射作用后均能减轻瘤重和瘤体积，抑瘤率分别为（39.42±8.47）%、（42.85±12.15）%及（74.80±11.85）%，而藻蓝蛋白联合激光照射作用的抑瘤率与CY 组抑瘤率（78.58±8.87）%相近，表明藻蓝蛋白联合光动力疗法对于抑制肿瘤的生长具有良好的效果。激光照射组的抑瘤率达到30%，亦认为具有一定的抑瘤作用［19］。
本实验的小鼠体内实验结果表明，模型组小鼠的免疫器官脾重和脾指数明显降低。经过激光照射、藻蓝蛋白作用后小鼠的脾重和脾指数均显著增加，表明激光照射、藻蓝蛋白处理均能够促进小鼠脾脏的生长发育，且藻蓝蛋白联合激光照射的小鼠脾重和脾指数升高更显著，其机制可能是通过引起免疫器官活性细胞的增生反应［20］，增强小鼠机体免疫活性。
肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是至今为止发现的最强的抗肿瘤细胞因子［21］，具有抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等生物学活性［22］。有研究表明，TNF-α 在体内可以直接诱导肿瘤细胞凋亡，可以通过多途径综合机制发挥抗肿瘤作用和调节免疫效应［23］。白介素-6（IL-6）是活化的T 细胞产生的淋巴因子，能使B 细胞前体成为产生抗体的细胞，与炎症性疾病和感染程度直接相关。早期研究表明，IL-6 能够通过诱导免疫反应来直接或间接地抑制肿瘤细胞的生长而发挥抗肿瘤作用［24］。本实验结果显示：藻蓝蛋白处理及藻蓝蛋白联合激光照射作用后TNF-α 和IL-6 表达量均高于模型组，其中二者联合作用效果更显著。恶性肿瘤患者随着病程延长和疾病的恶化，往往会伴随着机体免疫系统功能下降，并且免疫功能下降随着放疗、化疗次数增加更为明显。藻蓝蛋白和激光照射能使患癌小鼠TNF-α和IL-6水平显著提高，调节机体免疫效应，这可能是其抗肿瘤的作用机制之一。
综上所述，藻蓝蛋白能有效抑制体内肿瘤组织的生长，其介导的光动力疗法联合治疗小鼠SW1990 肿瘤的效果更加显著，能提高患癌小鼠免疫器官的脾指数，促进患癌小鼠TNF-α 和IL-6 的表达水平。提示藻蓝蛋白联合光动力疗法有可能通过调节机体的免疫功能来达到抑制肿瘤生长的目的。
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