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张丽虹 赵小贞 王 玮
（福建医科大学人体解剖学系，临床应用解剖学研究室，脑老化与神经变性疾病福建省高校重点实验室，福州 350122）
精索静脉曲张（varicocele，VC）是男性生殖系统中常见的疾病之一[1-6]。VC的病理学机制以及造成男性不育的机制包括由于血液循环受阻造成的睾丸高温、神经内分泌系统紊乱、血-睾屏障（blood-testis barrier，BTB）损伤等[7-9]。巴戟天为茜草科藤状灌木的根（拉丁名为Morinda officinalis F.C.How），中医认为巴戟天具有壮阳补肾、固精安神、强筋壮骨的功效[10]，巴戟天多糖（Morinda officinalis polysaccharide，MOP）是巴戟天中主要的生物活性成分之一，含量为11%～35%[11-12]。本课题组前期研究表明MOP能够修复损伤的生精上皮和BTB，减少生殖细胞凋亡，调节紊乱的激素水平趋于正常，减少血清抗精子抗体水平等[13-15]，但具体机制尚未明确。蛋白质组指由一个基因组、一个细胞或组织、一种生物体所表达的全部蛋白质的总称[16-17]。本研究将300 mg/kg MOP用于VC大鼠的治疗，采用串联质谱标签（Tandem Mass Tag，TMT）分析法对左侧睾丸组织进行蛋白质组学研究，旨在从蛋白质组水平阐述VC的致病机制以及MOP修复作用的机制。
1.1 主要试剂
蛋白酶抑制剂（康成生物公司）；
三（2-羧乙基）膦（Sigma-Aldrich公司）；
碘乙酰胺（Sigma-Aldrich公司）；
三乙胺碳酸氢盐（Sigma-Aldrich公司）；
无水乙腈（Sigma-Aldrich公司）；
C18液相色谱柱（Sigma-Aldrich公司）；
羟胺（Sigma-Aldrich公司）；
甲酸（Sigma-Aldrich公司）；
Trypsin/Lys-C Mix（Promega公司）；
脱氧胆酸钠（生工生物工程公司）；
乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40，生工生物工程公司）；
Dextran（Sigma-Aldrich公司）。
1.2 MOP提取和化学指纹图谱分析
1.2.1 MOP提取 巴戟天粉末200 g，用3倍量的95%乙醇沸水浴回流提取2 h，共3次，除去巴戟天药材中的脂溶性成分以及寡糖；
药渣自然挥发至无醇味，用6倍量的双蒸水沸水浴提取2 h，共3次；
合并药液，使用旋转蒸发仪对巴戟天水提物进行浓缩，至比重达到1.2 g/mL；
加入无水乙醇，使乙醇含量达到60%，4℃过夜，收集沉淀，得到巴戟天粗糖；
加等量水溶解，加入1/3体积的sevag试剂（氯仿∶正丁醇=1∶4），置于分液漏斗中，振摇，静置分层1 h，除去下层氯仿和中间层变性蛋白质，共3次，得脱蛋白的巴戟天总多糖；
pH值调至9.0，采用30% H2O260℃除色30 min；
加入无水乙醇，使乙醇含量达到60%，4℃过夜，收集沉淀；
依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀，烘箱干燥，得到MOP粉末，采用蒽酮硫酸法测定产物中多糖含量。
1.2.2 红外光谱测定 取干燥MOP粉末1 mg，与适量干燥KBr粉末混合后在研钵中研磨至极细，经压片后测定红外光谱。
1.2.3 高效凝胶柱法测定MOP分子量范围 采用UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm凝胶柱，流动相为0.1 mol/L硝酸钠溶液，流速为0.8 mL/min，柱温30℃，进样20 μL；
标样为已知分子量的葡聚糖标准品Dextran，分子量分别为2 000 000、133 800、36 800、9 700、2 700、180 Mw，检测器为Waters 1525高效液相色谱仪（配2410示差折光检测器和Empower工作站）。将已知分子量的葡聚糖标准品和MOP粉末分别用流动相配制成1.0 mg/mL的溶液，进样量为20 μL，记录色谱图。用Breeze GPC软件以标准葡聚糖分子量的对数（logMw）对洗脱时间（T）进行回归处理，最终得到的标注曲线方程为logMw=13.5-0.51T，R2=0.99815。根据MOP的保留时间，应用标准曲线计算多糖分子量。
1.3 实验动物与分组
18只健康雄性SD大鼠（200±20）g，购买和饲养于福建医科大学实验动物中心，将其随机分为假手术组、VC模型组、VC+MOP给药组，每组6只。假手术组：打开腹腔，暴露左肾静脉，但不进行结扎，术后常规饲养12周后取材。VC模型组：VC手术后常规饲养8周，再给予生理盐水灌胃4周后取材。VC+MOP给药组：VC手术后常规饲养8周，再给予300 mg/kg MOP灌胃治疗4周后取材。
1.4 精索静脉曲张大鼠模型制作
采用部分结扎左肾静脉的方法制作VC大鼠模型。各组大鼠腹腔注射氯胺酮进行麻醉后，腹部备皮，乙醇消毒，腹部正中切口，显露腹腔，将腹腔内容物推向右侧，暴露左肾、下腔静脉、左肾静脉和左侧睾丸静脉。钝性分离左侧肾静脉注入下腔静脉处的壁腹膜，将一根直径为0.8 mm的金属杆与左肾静脉平行放置，与左肾静脉一起结扎，结扎后将金属杆拨出，将腹腔内容物复位后，关腹，缝合，在切口处洒青霉素预防感染。假手术组进行相同的手术步骤，但不进行左肾静脉部分结扎。取材时采用氯胺酮腹腔注射麻醉大鼠，剖腹观察，VC模型组和VC+MOP给药组大鼠若出现左侧精索内静脉扩张（左侧精索静脉直径至少为右侧精索静脉直径的3倍）且2个肾质量相似，则表明手术成功。假手术组大鼠精索静脉则未见扩张。随后采用颈椎脱臼的方法处死大鼠，切开阴囊取左侧睾丸组织，放入干冰中储存。
1.5 蛋白质组学分析方法
TMT标记的定量蛋白质组学分析实验由康成生物公司完成，每组取3个样本，共9个样本。样本采用RIPA裂解液提取样本总蛋白，并采用BCA法测定总蛋白浓度。取100 μg总蛋白，加入三（2-羧乙基）膦和碘乙酰胺使二硫键还原和烷基化，加入丙酮沉淀蛋白，收集蛋白后采用100 mmol/L 三乙胺碳酸氢盐重溶蛋白，用胰蛋白酶酶切蛋白得到多肽。采用TMT标签对9个样品的多肽进行标记，随后将所有样品等量混合成一个样品。采用甲酸沉淀，并离心去除脱氧胆酸钠，C18液相色谱柱使样品中的多肽脱盐，随后进行LC-MS/MS分析和数据库比对，鉴定出样品中蛋白组成以及每个蛋白在9个样品中的相对含量。取4 μg多肽样品经纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000 进行分离，并使用在线质谱仪 （QExactive） 进行检测。LCMS/MS原始数据使用MaxQuant （版本号：1.5.5.1）进行搜库和定量分析。蛋白数据库为Uniprottaxonomy_10116 （Canonical & Isoform）。
1.6 生物信息学分析
将差异表达倍数＞25%，P＜0.05的蛋白视为显著差异表达蛋白，并对差异表达蛋白进行后续基因本体（gene ontology，GO）、日本京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，运用在线 STRING（https://string-db.org/）蛋白质相互作用网站进行蛋白质相互作用分析。
1.7 统计学处理
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，采用单因素ANOVA分析及TukeyHSD法筛选差异表达蛋白。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 MOP红外光谱化学指纹图谱分析
2.1.1 MOP红外光谱图 图1A为MOP的红外光谱图，其中3 384 cm-1为 O-H的伸缩振动吸收峰；
2 929 cm-1为C-H的伸缩振动吸收峰；
1 644 cm-1为C=O的红外吸收峰；
1 417 cm-1、1 325 cm-1为 C-H的弯曲振动吸收峰；
1 101 cm-1～1 023 cm-1为糖苷键-O-C的红外吸收峰，873 cm-1可能为β-型糖苷键的特征吸收峰。综上，MOP样品的红外光谱图存在有糖类物质的特殊吸收峰。
2.1.2 MOP的分子量范围 如高效凝胶柱图谱（图1B）所示，MOP分别在14.70、17.63、20.49 min处出现3个峰，所占面积百分比分别为4.9%、19.7%、75.4%。MOP主要成分的平均分子量为1 506 Mw，面积归一比例占75.4%。
图1 MOP红外光谱化学指纹图谱分析
2.2 蛋白质组学分析
TMT标记多肽的效率为96%，鉴定到的总多肽数为14 742，总蛋白数为2 510，可定量的蛋白数为2 412，3组间总差异表达蛋白数为57。VC模型组和假手术组相比差异蛋白总数为46个（表1），VC+MOP给药组与VC模型组相比差异蛋白总数为21个（表2），VC+MOP给药组与假手术相比差异蛋白总数为5个（表3）。差异表达蛋白采用对应的基因名展示。组间差异表达的蛋白火山图展示结果如图2（见封三）所示，仅对差异表达倍数＞ 0.5的蛋白进行注释。层次聚类分析如图3（见封三）所示，差异表达蛋白采用对应的基因名展示。
图2 组间差异表达蛋白火山图。A：VC模型组与假手术组间差异表达蛋白火山图；
B：VC+MOP给药组与VC模型组间差异表达蛋白火山图；
C：VC+MOP给药组与假手术组间差异表达蛋白火山图。红点表示表达升高的蛋白，绿点表示表达降低的蛋白，仅对差异表达倍数＞0.5的蛋白进行注释.
图3 组间差异表达蛋白层次聚类分析和差异表达蛋白相互作用分析。A：VC模型组与假手术组间差异表达蛋白层次聚类分析；
B：VC+MOP给药组与VC模型组间差异表达蛋白层次聚类分析；
C：VC+MOP给药组与假手术组间差异表达蛋白层次聚类分析；
D：差异表达蛋白相互作用分析.
表1 VC模型组与假手术组间差异表达蛋白
表2 VC+MOP给药组与VC模型组间差异表达蛋白
表3 VC+MOP给药组与假手术组间差异表达蛋白
2.3 组间差异表达蛋白GO富集
GO富集通路包括细胞组成（cellular component，CC）、生物过程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）3种类别，组间差异表达蛋白GO富集结果见表4，仅展示与本研究相关的富集通路（P＜0.05），差异表达蛋白采用对应的基因名展示。
表4 差异表达蛋白GO通路富集
2.4 差异表达蛋白KEGG通路富集
组间差异表达蛋白KEGG通路富集（P＜0.05）结果见表5，差异表达蛋白采用对应的基因名展示。
表5 差异表达蛋白KEGG通路富集
2.5 蛋白质相互作用分析
蛋白质相互作用网站分析结果显示，53个基因间存在显著富集的相互作用，分析结果总结如图3D（见封三）所示，蛋白质-蛋白质相互作用富集P值为0.0121，线条粗细代表互作强度，差异表达蛋白采用对应的基因名展示。
3.1 MOP减少由VC引起的睾丸组织内差异表达蛋白数量
蛋白质组学研究是近年新兴的科研手段，不仅为揭示生命活动规律提供基础，并且对于阐明疾病的病理机制以及寻找诊断和治疗靶点具有重要意义。在前期的实验中课题组发现300 mg/kg MOP对VC大鼠睾丸修复效果最佳。为进一步阐述MOP的修复机制，本研究根据蛋白质组学筛选的差异表达蛋白检测发现，VC模型组和假手术组相比差异蛋白总数为46个，而VC+MOP给药组与假手术组相比差异蛋白总数仅为5个；
结合差异蛋白的火山图和层次聚类分析结果，可见VC模型组与其他2个组相比差异蛋白数较多，蛋白表达水平差异较大。由此可见，MOP能使由VC引起组间的差异表达的蛋白数量减少，蛋白质组成相似，蛋白质表达水平趋于正常，这从蛋白质整体水平反映了MOP对于VC引起的睾丸损伤的修复作用。
3.2 关键差异表达蛋白分析
通过对差异表达蛋白进一步筛选和分析，显示VC会引起Pla2g6蛋白表达升高；
而给予MOP后，Pla2g6蛋白表达水平降低，提示MOP能逆转由VC引起的Pla2g6蛋白表达水平升高，可能是VC和MOP修复作用中的关键蛋白分子之一。Pla2g6属于一种胞质内非Ca2+依赖型磷脂酶A2[18-19]，能够分解膜磷脂产生花生四烯酸和前列腺素，参与磷脂重塑和自杀相关蛋白（Fas蛋白）诱导的细胞凋亡信号传递。Pla2g6分解膜磷脂产生的花生四烯酸和溶血磷脂广泛参与了细胞内信号转导过程，影响蛋白质磷酸化水平，例如参与动脉血管的松弛、血管平滑肌收缩等过程[20]。Pla2g6一直被认为是铁离子沉积性神经变性病的致病基因之一[21]，由Pla2g6基因突变引起的疾病被称为 Pla2g6相关性神经变性，例如婴儿神经轴索营养不良和帕金森病[22-23]。而Pla2g6蛋白在睾丸组织中的生物学功能和参与雄性生殖系统疾病发生的机制及相应的治疗研究国内外还未见报道。笔者推测Pla2g6组间表达水平差异可能与VC的病理机制和MOP的修复作用相关，并且可能是通过分解磷脂以及产生的代谢物，广泛参与细胞内信号传递过程、影响蛋白质磷酸化水平、扰乱细胞内肌动蛋白骨架系统稳态、影响支持细胞紧密连接等过程实现的，但具体机制还需要进一步实验证实。此外，Akap8l、Aldh1a7、 Bcs1l、Cbr1、Efl1、Eif6、Hsd17b12、Rpl37a、Slc35f6、Yipf5蛋白在VC模型组和假手术组之间表达上调，而在VC+MOP给药组和VC模型组之间表达下调，提示MOP能够逆转由VC导致的上述蛋白表达上调；
Crp在VC模型组和假手术组之间表达下调，而在VC+MOP给药组和VC模型组之间表达上调，提示MOP能够逆转由VC导致的Crp表达下调，这
些蛋白可能在VC和MOP的修复作用中扮演重要角色。
3.3 生物信息学分析
根据GO通路富集结果，VC模型组与假手术组间差异表达蛋白富集于凋亡信号通路的调控、激素水平调节、体液免疫应答、睾酮反应等通路，这与笔者前期实验的结果基本一致，即VC能够引起生精上皮和BTB损伤、生殖细胞凋亡、血清性激素水平紊乱以及增加血清抗精子抗体水平等[15]；
VC+MOP给药组和VC模型组间差异表达蛋白富集于凋亡信号通路的调控、类固醇脱氢酶活性等通路，同样与课题组前期实验的结果基本一致，即MOP能够减少生殖细胞凋亡、调节紊乱的血清性激素水平趋于正常、增加睾丸组织内雄激素水平等[15]；
VC+MOP给药组和假手术组间差异表达蛋白富集于膜脂质生物合成过程、正向调控蛋白激酶C信号转导、正向调节血液循环等通路，提示MOP的修复作用可能也与上述生物学过程相关。此外，差异表达蛋白主要富集于代谢相关的KEGG通路，提示VC和MOP可能对睾丸内的物质代谢过程产生影响，但物质代谢对于精子发生过程的影响有待进一步研究。
