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张宏伟，王彩茹，缪国东，张化玉，高福洋，刘海英
（承德市中心医院，河北 承德 067000）
胆管癌是一类侵袭性肿瘤，恶性程度较高，病情具有隐匿性特征，该病诊断率低、病死率高。治疗最有效的方法是手术切除，术后复发率较低，对放疗与化疗不敏感，预后情况较差。有医学研究表示：胆管系统中的自主神经较为活跃，腹腔神经丛距离胆管恶性肿瘤较近，周围神经丛容易受到肿瘤的侵袭，导致神经浸润[1]。多次实践研究得出：胆管癌经由胆管癌周围神经递质分泌诱发胆管癌神经浸润所导致。周围神经递质主要依靠激活毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3（ChRM3）而发挥的作用，会对胆管癌神经浸润产生较强的抑制。本研究主要针对激动剂匹罗卡品、抗结剂阿托品对ChRM3的作用，研究胆管癌神经浸润能力所受的影响，下面是研究报道。
1.1 临床资料 筛选经外科手术切除的胆管病理组织标本90例展开研究，标本均用石蜡包埋，重新筛选腺癌组织标本60例，正产胆管组织标本30例。
1.2 方法
1.2.1 细胞系与所选试剂 胆管癌（RBE细胞系）从上海细胞库购买，美国提供胎牛血清（FBS）、培养基RPIM1640、匹罗卡品，武汉昌恒生物医药制品研究所提供硫酸阿托品，青岛市药检所动物实验中心提供昆明种纯系胚胎小鼠。
1.2.2 培养细胞 胆管癌细胞（RBE）系运用的培养液：胎牛血清RPMI1640（体积分数0.10），温度处于37oC，运用CO2恒温养箱体积分数0.05进行培养，定期更换培养液，等细胞融合80%-90%后，使用于含有2.5 g/L EDTA的胰酶消化，配置为细胞悬液，于培养瓶上接种，取出对数生长期的细胞使用胰酶2.5 g/L EDTA消化待用，每天采用显微倒置观察细胞的生长情况，在规定时间内将其拍照记录。
1.2.3 构建体外胆管癌神经浸润模型 将本研究小鼠 DRGRBE 细胞共培养模型培养液分为4组，甲组（仅加含血清培养基RPMI1640）、乙组（含有血清培养基RPMI1640＋匹罗卡品1 mmol/L）、丙组（含血清培养基RPMI1640＋阿托品0.1 mmol/L＋匹罗卡品1 mmol/L）、丁组（含有血清培养基RPMI1640＋阿托品0.1 mmol/L）。取出RBE胆管癌细胞（对数期生长）候用，消化以2.5 g/L胰酶进行，离心后运用胎牛血清RPMI1640培养液处理RBE胆管癌细胞并计数，细胞密度调整在1.0×108个L待用。操作期间应选取整洁干净的工作平台，脱颈将小鼠处死，于显微镜下对小鼠的背根神经节进行修剪，然后将其放在生理盐水中清洗。于孔板上各小孔放上1 cm×1 cm消毒盖玻片预冷，于盖玻片中央放置DRG，覆盖50 μL Matrigel，在培养箱中放置6孔板，温度保持在37oC，固化时间达30 min，将准备好的细胞悬液分别加入其中，覆盖Matrigel和DRG ，选取培养箱（体积分数0.05）CO2培养，每隔4 h在显微镜下观察神经纤维黏附状况、RBE细胞，详细记录细胞变化。36 h后选取中性甲醛溶液（40 g/L）将其固定，利用Nissl染色后运用显微镜观察，计数采用高倍镜，将高倍镜调节为5进行细胞计数，计算平均数值。
1.3 观察指标 观察DRG-RBE细胞共培养模型培养36 h后添加不同试剂的浸润细胞数目。
在DRG-RBE细胞共培养模型培养36 h后，浸润细胞数目为18.0±0.71；
添加匹罗卡品后，浸润细胞数目31.60±0.93，差异显著（P＜0.05）；
添加匹罗卡品拮抗剂阿托品后，浸润细胞数目为20.0±0.71，单独添加阿托品后，浸润细胞数目为20.20±0.86，差异显著（P＜0.05）。
本研究加入匹罗卡品、阿托品后，ChRM3激动剂匹罗卡品能够明显增强RBE细胞浸润能力，阿托品可以削弱匹罗卡品产生的促浸润作用[2]。阿托可结合匹罗卡品ChRM3，实现对匹罗卡品的抗击，阿托品从原则上来说无法与ChRM3结合，效果的发挥存在难度，若单独应用阿托品，难以制约RBE细胞的神经浸润。
总体来说，匹罗卡品能够增强胆管癌细胞的神经浸润功能，阿托品会削弱匹罗卡品浸润能力，可改善ChRM3的活性，可以为抑制胆管癌的神经浸润提供新的治疗靶点。
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