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王 庆，田 雨，齐喜红，董文静，苟小慧，朱彦华，赵建军
枸杞子为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实，其味甘、性平，归肝、肾经,具有滋补肝肾，益精明目的功效，可用于治疗虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、阳痿遗精、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明等病症。主要化学成分有枸杞多糖、生物碱、氨基酸、黄酮类、维生素、微量元素等。枸杞子作为常用中药，收载于《中国药典2020年版》[1-2]。冷冻干燥技术在中药材或中药饮片的加工中研究不多。本研究建立烘干及冻干不同干燥枸杞饮片指纹图谱，同时考察枸杞多糖、甜菜碱、玉米黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯等理化指标含量，为创新中药饮片炮制工艺提供实验资料和科学依据。
1.1 一般资料：(1)仪器：高效液相色谱仪(1260型，安捷伦科技有限公司)，METTLER XS205 电子天平(十万分之一，德国)，岛津2550紫外分光光度计，Elmasonic P120H 超声波清洗机(德国Elma公司)，飞鸽牌高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。(2)试剂：冰醋酸(Tedia,色谱级)，甲醇、乙腈、石油醚、丙酮(赛默飞世尔科技有限公司，色谱级)，高纯水,二氯甲烷(DIKMA TECHNOLOGIES INC,色谱级)，正己烷(国药集团化学试剂有限公司，色谱级)。枸杞子烘干品是将采收的枸杞子鲜果经清洗、热风烘干、除去杂质而得；
冻干品是将枸杞子鲜果经喷淋洗、风干后采用真空冷冻干燥技术脱水，并经拣选等工序加工而成。以上枸杞子样品均为宁夏早康生物科技有限公司提供，由宁夏药品检验研究院中药室王庆主任鉴定为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实。
1.2 材料：无水葡萄糖对照品(批号110833-201908，中国食品药品检定研究院)；
甜菜碱对照品(批号110894-201604，中国食品药品检定研究院)；
β-胡萝卜素(批号100445-201802，含量29.8%，中国食品药品检定研究院)；
玉米黄素(批号E0025303,含量93.5%，曼哈格生物科技有限公司)；
玉米黄素双棕榈酸酯(批号A24GB14668，上海源叶生物科技有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 指纹图谱的建立[3]
1.3.1.1 HPLC分析条件：色谱柱Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相由0.3%冰醋酸(A)和乙腈(B)组成；
梯度洗脱;检测波长310 nm;柱温25 ℃；
流速1.0 mL/min;进样量20 μL，见表1。
表1 梯度洗脱条件
1.3.1.2 供试品溶液的制备:精密称取烘干枸杞、冻干枸杞各约3.0 g,置于150 mL锥形瓶中，加水45 mL，60℃超声提取30 min，提取液在3 000 r/min条件下离心10 min，将离心液转移至50 mL容量瓶中，用水定容至50 mL，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
1.3.1.3 指纹图谱考察方法:①取烘干枸杞1号样品的供试品溶液，连续进样5次，记录色谱图，以22号峰为参照峰,见图3(封三)，计算主要色谱峰的相对保留时间的RSD为0.01%～0.38%，相对峰面积的RSD为1.83%～2.92%，表明仪器精密度良好。②取烘干枸杞1号样品的供试品溶液在0、2、4、6、8、24 h检测，记录色谱图，以22号峰为参照峰，见图3(封三)，计算主要色谱峰的相对保留时间RSD为0.15%～2.39%，相对峰面积的RSD为1.20%～2.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。③取烘干枸杞1号样品的供试品溶液6份，分别进样，记录色谱图，以22号峰为参照峰，见图3(封三)，计算主要色谱峰的相对保留时间的RSD为0.02%～0.12%，相对峰面积的RSD为1.47%～2.94%，表明方法重复性良好。
1.3.2 指纹图谱分析
1.3.2.1 共有模式的确定:分别称取10批烘干枸杞粉末与10批冻干枸杞粉末，制备供试品溶液分别进样测定，将得到的10批烘干枸杞HPLC色谱图的数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)。以烘干枸杞1号样品的HPLC色谱图为参照图谱，生成10批烘干枸杞样品的共有模式R，见图1(封三)，然后将10批冻干枸杞样品的HPLC色谱图与10批烘干枸杞的共有模式R图谱数据导入到上述软件中，以10批烘干枸杞样品的共有模式R为参照图谱，采用中位数法进行多点校正，时间窗宽度为0.3 s,进行自动匹配，建立冻干枸杞对照指纹图谱,见图2(封三)，共确定24个共有峰，见图3(封三)。
1.3.2.2 色谱图中共有峰面积:对10批烘干枸杞样品的共有模式R与10批冻干枸杞样品的指纹图谱进行分析和比较，经计算供试品色谱图中共有峰面积占总峰面积均在70%以上，符合指纹图谱要求。
1.3.2.3 相似度分析:将10批烘干枸杞，10批冻干枸杞HPLC色谱图的数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，进行相似度评价，计算10批样品之间的相似度，10批烘干枸杞之间的相似度分别为0.995、0.996、0.995、0.996、0.997、0.996、0.997、0.995、0.996、0.994；
10批冻干枸杞之间的相似度分别为0.990、0.997、0.998、0.997、0.998、0.998、0.997、0.996、0.998、0.996，结果均达到0.99以上，符合指纹图谱要求。再以10批烘干枸杞的共有模式R为参照图谱，计算与10批冻干枸杞的相似度，分别为0.997、0.999、0.995、0.993、0.994、0.999、0.996、0.997、0.996、0.997，结果均达到0.99以上。
1.3.3 甜菜碱含量测定
1.3.3.1 HPLC分析条件：色谱柱为Merck 氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
乙腈-水(85∶15)为流动相；
检测波长为 195 nm。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定。
1.3.3.2 供试品溶液的制备：取烘干枸杞、冻干枸杞粉碎，约取1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流 1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2 mL，置碱性氧化铝固相萃取柱(2 g)上，用乙醇30 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解，转移至 2mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀过滤，取续滤液。
一个物体在内河航道漂移，受到水流和风力的作用，假设在一定时间Δt内漂移速度相对稳定，那么物体的位置从tn时刻到tn+1时刻的更新为
1.3.3.3 对照品溶液的制备：取甜菜碱对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.17 mg的溶液。
1.3.3.4 样品测定：取烘干枸杞、冻干枸杞各10批样品粉末，制备供试品溶液，进样分析，测定峰面积，计算含量。
1.3.4 枸杞多糖含量测定
1.3.4.1 供试品溶液的制备：取烘干枸杞、冻干枸杞粗粉约0.5 g，精密称定，加乙醚100 mL，加热回流1 h，静置，放冷，小心弃去乙醚液，残渣置水浴上挥尽乙醚。加入80%乙醇100 mL，加热回流1 h，趁热滤过，滤渣与滤器用80%热乙醇30 mL分次洗涤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水150 mL，加热回流2 h。
1.3.4.2 对照品溶液的制备：精密取称无水葡萄糖对照品25.11 mg，置250 mL量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度后摇匀。
1.3.4.3 标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置具塞试管中，分别加水至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min。置40℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在490 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.4.4 样品测定:精密量取供试品溶液1.0 mL，置具塞试管中，精密加水1.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL时测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖的重量。
1.3.5.1 HPLC分析条件:①色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；
②流动相为乙腈-甲醇-正己烷-二氯甲烷(40∶15∶20∶20)；
③流速：1.0 mL/min;④柱温：25℃；
⑤检测波长：450 nm;⑥进样量：供试品10 μL,对照品5 μL。
1.3.5.2 供试品溶液的制备：称取烘干枸杞、冻干枸杞粉末1 g，精密称定，加入0.01%二丁基羟基甲苯(BHT)，15 mL石油醚-丙酮(2∶1)混合溶剂常温提取3次至残渣无色，每次30 min，合并提取液，转入分液漏斗，蒸馏水洗去水溶性成分，石油醚层用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩至干，石油醚定容至25mL，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。提取过程避光。
1.3.5.3 对照品溶液的制备:取玉米黄素、β-胡萝卜素适量，分别精密称定6.55、7.46 mg,加入二氯甲烷溶解后，流动相分别定容于10、100 mL量瓶中；
取玉米黄素双棕榈酸酯适量，精密称定0.96 mg,加入玉米黄素、β-胡萝卜素各1 mL后，流动相定容于10 mL量瓶中，即得。
1.3.5.4 样品测定：取烘干枸杞、冻干枸杞各10批样品粉末，按制备供试品溶液，进样分析，测定峰面积，计算含量。
1.3.6 其他指标的测定：对烘干枸杞、冻干枸杞各10批样品中水分、总灰分、浸出物、脂肪、蛋白质进行测定。
建立采用烘干及冻干不同干燥方式的枸杞子饮片指纹图谱，其方法精密度、重复性和稳定性良好。通过分析，不同干燥品共有峰面积大于70%，相似度均达到0.99以上。烘干和冻干品中甜菜碱、枸杞多糖等其他指标含量差异无统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 10批次烘干及冻干品各指标测定结果
本研究开展了枸杞子不同干燥方式中药饮片的质量对比研究，建立了HPLC指纹图谱，结合共有模式和共有峰的指认，通过相似度软件进行分析，不同干燥品共有峰面积大于70%，相似度均达到0.99以上，表明冻干枸杞与烘干枸杞质量品质无明显差异。同时通过对不同干燥方式枸杞子所含的指标成分甜菜碱、枸杞多糖和类胡萝卜素类成分玉米黄素、β-胡萝卜素和玉米黄素双棕榈酸酯进行含量对比测定，结合水分、总灰分、浸出物、脂肪等指标进行综合质量评价，结果显示冻干枸杞各项指无明显差异。枸杞子饮片冻干品内的物质基础与传统烘干品基本一致，可替代烘干品发挥药用价值。
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