【www.zhangdahai.com--其他范文】
王春晓，郝倩琳，于秋鸿，裴玉贺，宋希云，李 军
(青岛农业大学农学院, 山东 青岛 266109)
【研究意义】近年来作物生长季频繁发生的高温热害以及因自然降水不均匀造成的局部地区干旱等因素严重制约了作物的生长发育，造成全球作物“产量与品质”双下降。据统计，2006年我国川渝地区因高温和干旱造成的直接经济损失达216.4亿元，1980—2012年间美国因高温或干旱等灾害造成的损失高达约10亿美元[1-2]。研究发现，植物在遭受高温等逆境胁迫时，体内会积累大量的代谢产物如甲基乙二醛(MG)等[3]。MG是一类有毒的醛酮类代谢物，能够使多种细胞成分发生不可逆地修饰、形成加合物和交联，产生毒害效应[4]。细胞内MG的降解途径：一是依赖还原型谷胱甘肽(GSH)的途径，包括乙二醛酶1(GLY1)和乙二醛酶2(GLY2)；
二是不依赖GSH的途径，如乙二醛酶3(GLY3)[5]，最终将MG转化为无毒的乳酸，降低或消除其毒害作用[6]。乙二醛酶系统在动物细胞中研究得比较清楚，其参与细胞增殖、胚胎发生、成熟和细胞死亡等生物过程[7-9]，如临床上通过提高 Gly1的活性来治疗糖尿病和高血糖症[10]。【前人研究进展】植物Gly1基因迄今已在拟南芥、水稻、玉米和甘蔗等得到克隆，属于多基因家族[11]。Gly1的表达除了受非生物逆境和生物胁迫的诱导外，还受激素如生长素和细胞分裂素等的诱导，说明 Gly1蛋白参与植物对非生物、生物胁迫和激素信号的响应[12-15]。过表达Gly1和Gly2的转基因烟草和水稻表现出较强的耐盐和抗旱能力[6, 16-17]。另外，用茉莉酸处理的玉米幼苗 Gly1蛋白的活性比对照显著提高，且对盐碱的胁迫耐受能力明显增强[18]。【本研究切入点】迄今，对玉米ZmGly1的表达特性和生物学功能缺乏深入研究。【拟解决的关键问题】本研究利用生物信息学和qRT-PCR方法对ZmGly1编码蛋白的结构、理化性质和表达差异等进行解析，找出该基因在高温和干旱胁迫应答中的可能作用，以期为将来培育抗旱、耐热玉米新种质提供可利用的基因资源。
1.1 材料
本实验采用的玉米品种为“郑单958”。将种子播于含有营养土和蛭石(3∶1)的花盆(1粒/盆)中，置于青岛农业大学智能温室内(25 ℃)生长。待幼苗长至三叶期时分别进行干旱(20% PEG600)和高温(37 ℃)处理，在处理0、12、24、36、48 h后选取玉米的根、茎和叶，快速置于液氮中保存备用。每个处理含5棵幼苗，重复3次。
1.2 试剂
RNA提取试剂盒购自Takara公司；
反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；
引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。
表1 qRT-PCR所用引物
1.3 生物信息学分析
从NCBI网站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)检索到ZmGly1基因(登录号：NM_001153401)序列；
用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)软件分析ZmGly1基因编码蛋白的理化性质；
用TMHMM Server 2.0软件进行蛋白跨膜结构预测；
用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 进行蛋白质高级结构分析；
用MEGA 7.0软件对ZmGly1进行系统进化树分析。
1.4 总RNA提取、cDNA合成和表达模式分析
按照操作说明，用RNA提取试剂盒提取总RNA；
用反转录试剂盒合成cDNA；
用qRT-PCR分析表达模式，以玉米Actin作为内参基因。
2.1 ZmGly1蛋白的理化性质分析
用ProtParam tool软件分析发现，ZmGly1基因的cDNA序列为669 bp，编码222个氨基酸，理论分子量为24.98 kD，等电点为6.6。对氨基酸组成分析发现，带负电荷的氨基酸(Asp + Glu)残基总数为30，带正电荷的氨基酸(Arg + Lys)残基总数为29，Leu含量最高，占8.1%；
Cys含量最少，占0.9%。疏水系数是-0.448，为亲水性蛋白。TMHMM Server软件分析发现，该蛋白不含跨膜结构域，为细胞质蛋白(图1)。
图1 ZmGly1跨膜结构域预测
2.2 ZmGly1蛋白结构分析
用SOPMA软件对ZmGly1蛋白的二级结构分析发现，在二级结构中N端为无规则卷曲部分，占比约49.13%；
其次是α螺旋，占比为23.04%；
β转角占比为7.39%，其余的延伸链结构(图2-a)。用SWISS-MODEL软件对ZmGly1蛋白的空间结构分析发现，ZmGly1是一种金属酶，在蛋白质的A链和B链上含有4个结合Zn2+的配体氨基酸残基，即His162、Glu208和Gln68、Glu134(图2-b)。
a.二级结构模型；
b.空间结构模型和金属结合位点
2.3 系统进化树分析
用BLAST程序从NCBI数据库中检索与ZmGly1同源的其他植物的蛋白序列，然后选取氨基酸序列同源性≥60%的14种植物进行进化树分析。结果表明ZmGly1蛋白与高粱SbGly1同源性为92.51%，亲缘关系最近；
与三裂叶薯MeGly1的同源性为67.81%，亲缘关系最远(图3)。
BdGly1为二穗短柄草; BhGly1为冬瓜; CmGly1为笋瓜; CsGly1为亚麻荠; DeGly1为福尼奥小米；
McGly1为苦瓜; MeGly1为木薯; ObGly1为短花药野生稻；
OsGly1为粳稻; PvGly1为柳枝稷；
SbGly1为高粱；
SiGly1为粟; SvGly1为狗尾草；
ZmGly1为玉米
2.4 ZmGly1基因的组织特异性表达
如图4所示，ZmGly1基因在玉米根、茎和叶片中均有表达，其中，叶片中的相对表达量最高，分别是根和茎中表达量的4.3和3.1倍。
图4 ZmGly1在不同组织的相对表达量
2.5 ZmGly1基因在高温和干旱逆境胁迫下的表达情况分析
如图5-a所示，与对照相比，高温处理下ZmGly1在叶片中的表达随时间的延长呈现出先降低后升高再降低的趋势。如在高温处理12 h后表达量显著降低，为对照的57%；
但在处理24 h后表达量显著升高，为对照的1.2倍，之后表达量下降，到处理48 h后表达量约为对照的97%。如图5-b所示，与对照相比，干旱处理下ZmGly1在叶片中的表达随时间的延长呈现出先升高后降低的趋势。在干旱处理12 h后表达量较高，是对照的1.1倍；
之后表达量逐渐下降，如在处理48 h后的表达量为对照的60%。
图5 高温(a)和干旱(b)胁迫下ZmGly1基因的相对表达量
玉米是一种重要的粮饲兼用作物。然而，夏玉米生产常因季节性高温和由高温诱发的干旱等双重灾害导致玉米减产，因此挖掘抗逆优异基因进而培育抗性较强的玉米品种是减少高温热害损失的有效途径[19]。乙二醛酶1(Gly1)是依赖GSH途径的限速酶，在细菌、酵母、动植物等生物体中普遍存在[20]。Gly1发挥着重要的解毒功能，能够有效降低细胞中的甲基乙二醛含量，清除比例可达99%[21]。拟南芥Gly1是一类依赖金属离子的蛋白酶，催化活性需要 Ni2+和Zn2+作为辅因子[22]。对ZmGly1基因的生物信息学分析发现，ZmGly1基因的分子量为24.98 kD，是一种亲水性蛋白。由于缺乏跨膜结构域，推测该蛋白定位于细胞质中。在蛋白质的二级结构中还有较高比例的α螺旋和β转角，这对维持ZmGly1蛋白的构象稳定起重要作用。与拟南芥Gly1类似，ZmGly1蛋白也是一种金属酶， 但需要Zn2+作为辅因子，在蛋白的A链和B链上各包含1个Zn2+金属结合位点，分别位于His162、Glu208和Gln68、Glu134。通过对14种植物Gly1蛋白氨基酸序列同源性分析发现，ZmGly1与高粱SbGly2同源性最高，亲缘关系最近。
GLY1是一个基因家族，已有研究发现在拟南芥基因组中有11个编码GLY1的同源基因[23]。对其转录本丰度分析发现，AtGLY1不仅在营养器官如叶、根中表达，也可在繁殖器官如花、角果中表达，如AtGLY1.1在叶片中的转录本丰度最高，在根中最低；
且AtGLY1对干旱、高盐、冷、热和高光响应的转录本丰度呈现多样性，如AtGLY1.1对干旱、盐、冷和热应答的转录本丰度下降，而对高光的响应升高；
AtGLY1.2对盐、冷和热应答的转录本丰度下降，而对干旱、高光的响应增加。qRT-PCR分析结果显示，ZmGly1基因在不同组织器官中的表达水平存在差异，在叶片中的表达量最高，而在根和茎中表达量相对较低，这与Schmitz等[23]报道的AtGLY1.1结果一致。ZmGly1基因应对干旱和高温胁迫的表达情况有差异，如干旱处理下ZmGly1基因在叶片中的表达随时间的延长呈现出先升高后降低的趋势，但在高温处理下随时间的延长呈现出先降低后升高再降低的趋势。
玉米乙二醛酶1作为依赖Zn2+的蛋白酶，与高粱的亲缘关系最近，通过改变ZmGly1基因的表达来调控玉米对高温和干旱的胁迫应答，但具体的生物学功能还有待于进一步解析。
猜你喜欢 氨基酸试剂盒高温 高温干旱持续 农作物亟须“防护伞”今日农业(2022年16期)2022-11-09高温季蔬菜要如此培“根”固本今日农业(2022年15期)2022-09-20全球高温环球时报(2022-06-20)2022-06-206种非洲猪瘟荧光PCR试剂盒对比试验湖南畜牧兽医(2021年6期)2022-01-24鹅掌柴蜂蜜氨基酸组成识别研究食品安全导刊(2021年21期)2021-08-30农药残留快速检测试剂盒的制备方法及其应用研究食品安全导刊(2021年21期)2021-08-30第四代核电 高温气冷堆中国核电(2021年3期)2021-08-133 个不同国产乙肝病毒DNA 实时荧光定量PCR 检测试剂盒检测结果的比较质量安全与检验检测(2020年6期)2020-02-01试剂盒法制备细胞块的效果及其技术要点天津医科大学学报(2019年6期)2019-08-13月桂酰丙氨基酸钠的抑菌性能研究中国洗涤用品工业(2019年4期)2019-05-11本文来源：http://www.zhangdahai.com/shiyongfanwen/qitafanwen/2023/0714/625175.html
