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王建文，丁玉泽，李璐伶，姚新奎，曾亚琦，闫 睛，任万路，王川坤，孟 军
(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；
2.新疆马繁育与运动生理重点实验室/新疆农业大学马产业研究院，乌鲁木齐 830052)
【研究意义】马肉营养价值高[1]，肉马养殖效益良好，马匹繁育时代间隔长，选种准确性关系到马匹培育质量，筛选LPL基因中与伊犁马肉质性状相关的突变位点，将研究结果与传统选育方法相结合，有利于加快专门化肉用马培育进程，对加快肉马发展具有重要意义。【前人研究进展】脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)属于脂肪酶基因家族成员，主要由脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞合成与分泌，在甘油三酯及脂蛋白代谢和运输中具有重要的作用[2]，广泛分布于机体的肌肉和脂肪组织中[3]。LPL基因通过对甘油脂代谢、类固醇生物合成等信号通路调控，影响到脂肪的代谢与合成、沉积[4]。LPL基因在肉质及其胴体性状选择应用广泛[5]。LPL基因表达较高的部位肌内脂肪含量将会有所上升[6]，对羊的研究结果也与此基本一致[7]，肉品的剪切力较小[8]，肉品的嫩度将得到改善[9]。LPL基因突变有利于肌内脂肪的沉积、肉品的嫩度及色泽的改善[10]，猪LPL基因的G117IC位点突变将使得其pH值显著降低[11]，对于肌肉的成熟及其肉食用品质的提升有益。LPL基因的表达与其年龄及饲养条件有一定的关联[12]，LPL基因的表达会对LPL酶活性产生影响，对肌内脂肪的水解代谢起到重要的调节作用[13]，通过对酶活性的调节，影响到肌内脂肪的沉积与代谢，使得肉的品质得到改善[14-15]。【本研究切入点】分子生物学方法已广泛应用于其它家畜选种方面，但在专门化用途马培育方面的研究相对较少。需研究伊犁马脂蛋白脂酶基因多态性及其对肉质性状的影响。【拟解决的关键问题】研究以伊犁马为主要研究对象，测定LPL基因序列及其肉质性状，研究伊犁马LPL基因多态性及其与肉质性状之间的关系，筛选与伊犁马肉质性状相关的LPL基因多态位点，为专门化肉用马分子选育提供数据参考。
1.1 材 料
1.1.1 马 匹
选取41匹健康成年、伊犁马为研究对象，马匹膘情中等、无显著亲缘关系。马匹由伊犁哈萨克自治州昭苏马场提供。采用枸橼酸钠抗凝管采集颈静脉血液样本5 mL，混匀后置于-18℃冰箱待用。对所选马匹禁食24 h、禁水12 h后屠宰，立即采集三角肌、背阔肌、臂三头肌、腹外斜肌和臀中肌5个部位肌肉样本，成熟24 h后置于-18℃保存待用。
1.1.2 引物设计与PCR扩增
参照GenBank中公布的纯血马LPL基因序列(登录号：NC_009145.3)中第1外显子、第3外显子、第4外显子和第10外显子序列为目标片段，采用Primer软件进行引物设计，所设计引物由上海生工根据设计引物序列进行引物合成。表1
1.2 方 法
1.2.1 PCR扩增与基因多态性检测
本试验采用降落PCR法进行扩增，具体程序为：95℃预变性3 min，94℃变性30s，63℃退火45s，每个循环降低0.5℃，72℃延伸1 min，共计10个循环；
而后94℃变性30s，退火45s，72℃延伸1 min，共计30个循环，72℃修复延伸10 min。PCR扩增产物用1.5% TAE琼脂糖电泳进行检测。表2
表1 LPL基因引物基本信息
1.2.2 肉质性状检测
对所采集的肉样在4℃环境中排酸24 h后测定肉质性状。在4 000 r/min条件下离心20 min，测定肉样系水力；
在水浴锅中将肉样隔袋水煮30 min测定肉样熟肉率；
将煮熟的肉样沿肌纤维方向修整为横截面积为1 cm2的长条，采用物性仪测定肉样剪切力，每个样本重复测定10次，取最接近3次测定样本平均值为该肉样的剪切力。
1.3 数据处理
将符合条件的PCR扩增产物送至上海生工采用双向测序法进行测序，检测结果采用DNAStar软件校正，并与纯血马LPL基因序列(登录号：NC_009145.3)比对，采用BLAST确定突变位点及基因型。
采用HaploView 4.2软件对基因数据分析群体遗传学，运用Excel软件整理肉质性状，根据基因型进行分组，采用SPSS 18.0软件对肉质性状数据进行独立样本T检验，结果以平均数±标准差表示。
2.1 LPC基因引物PCR扩增
研究表明，各电泳条带清晰明亮，且无拖尾与杂带现象发生。第1泳道为第3外显子扩增产物，扩增片段长度约785 bp，第2泳道为第1外显子扩增产物，扩增片段长度约664 bp，第3泳道为第10外显子扩增产物，扩增片段长度约515 bp，第4泳道为第4外显子扩增片段，扩增片段长度约621 bp，各扩增片段长度均与目的片段长度相一致。图1
注：第1泳道为第3外显子，第2泳道为第1外显子，第3泳道为第10外显子，第4泳道为第4外显子
2.2 LPC基因测序同谱对比
研究表明，共计检测出2个SNP位点，其中第1个SNP位点位于第1外显子和第2外显子中间的内含子区域：g.715T>C，共检测出2种基因型(TT基因型和TC基因想)；
另一个SNP位点位于第4外显子和第5外显子中间的内含子区域：g.12074C>A，共检测出2种基因型(CC基因型和AC基因型)。图2
图2 LPL基因测序图谱
2.3 伊犁马LPL基因多态位点遗传学
研究表明，g.715T>C突变位点的优势基因型为TT基因型，优势等位基因为T；
g.12074C>A突变位点的优势基因型为CC基因型，优势等位基因为C；
χ2所检测出的两个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。所检测出的2个突变位点均为低度多态位点(PIC<0.25)。表3，表4
表3 LPL基因不同突变位点基因型及基因频率
表4 LPL基因不同突变位点遗传学特性
2.4 伊犁马LPL基因不同基因型对肉质性状的影响
研究表明，g.715T>C突变位点而言，在三角肌中TT基因型剪切力显著高于TC基因型(P<0.05)；
在背阔肌中TT基因型失水率显著高于TC基因型(P<0.05)，剪切力极显著高于TC基因型(P<0.01)；
在臂三头肌中TT基因型失水率极显著低于TC基因型(P<0.01)；
在腹外斜肌中TT基因型剪切力极显著低于TC基因型(P<0.01)；
在臀中肌中TT基因型失水率和剪切力显著高于TC基因型(P<0.05)。g.12074C>A突变位点，在三角肌中CC基因型熟肉率显著高于CA基因型(P<0.05)；
在背阔肌中CC基因型失水率显著低于CA基因型(P<0.05)；
在臂三头肌中CC基因型失水率极显著低于CA基因型(P<0.01)，熟肉率和剪切力极显著高于CA基因型(P<0.01)；
在腹外斜肌中基因型剪切力极显著高于CA基因型(P<0.01)，失水率和熟肉率显著低于CA基因型(P<0.05)；
在臀中肌中失水率CC基因型极显著低于CA基因型(P<0.01)。表5
表5 伊犁马LPL基因多态性与肉质性状关联
LPL基因在机体内各主要器官、组织中均有表达，在各种脂类代谢中起着重要作用[16]，LPL基因突变将导致其编码的蛋白活性发生变化，从而影响到其结构与功能，对动物肉品质产生影响[17]。马LPL基因位于2号染色体，编码471个氨基酸，共有10个外显子[18]，试验对伊犁马的4个外显子及其附近内含子区域进行多态性检测，共检测出2个内含子突变。大约每644～891 bp就会出现一个突变位点[19]，所检测出突变的扩增产物片段大小与此基本一致，通过比对序列显示，2个突变均为该基因突变位点。所检测出的2个突变位点均为内含子突变，且为新发现突变位点，可能是由于该基因在马匹方面的研究较少，暂时未能发现该突变位点；
可能是由于品种因素的影响[20]，伊犁马为我国自主培育品种，在其培育过程中曾引入部分品种对其进行改良，也可能是其出现新突变位点的因素之一[21]。χ2检验结果显示，这两个突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态，该群体基因型频率和基因频率具有较好的稳定性，遗传变异度相对较小，在后期人工定向选择时具有较大的潜力[22]。
研究将检测出的2个突变位点与伊犁马肉质性状进行关联性分析，研究结果显示g.715T>C和g.12074C>A突变位点在臂三头肌、背阔肌和臀中肌中两种基因型之间失水率均呈现出显著差异性，相关研究结果显示，失水率越低则肉质越好[23,24]，这2个突变位点对伊犁马肉品质产生一定影响，在选育的过程中可以加以利用；
但在三角肌中差异不显著，可能是由于试验中所选择的样本量相对较小所致，还需要加大样本量进行证实。熟肉率是肉品加工过程中的重要评价指标之一，熟肉率高则表明在加工过程中其失水较少，肉品的多汁性较好[2]，g.12074C>A突变位点三角肌和臂三头肌中CC基因型熟肉率较高，显示出该突变位点CC基因型肉品加工效率较好，在选育的过程中可以考虑以该基因型为主。g.715T>C位点背阔肌、腹外斜肌中剪切力呈极显著差异，三角肌、臀中肌中剪切力呈显著差异；
g.12074C>A臂三头肌、腹外斜肌中剪切力呈极显著差异，造成这种现象的原因可能是由于这两个突变位点虽然位于内含子区域，不会对蛋白质中氨基酸产生影响，但可能参与到该基因的表达调控或与其相关的功能基因一起产生影响，影响到该基因的表达，影响到该蛋白质的生理活性，导致其剪切力产生了一定的差异，但具体的原因还有待于进一步的机理性研究加以证实。对牛的研究结果显示，LPL基因表达量较高的部位其肌内脂肪含量会有所上升[25]，此时该部位肉品的剪切力会有所下降[26]，使得肉品的嫩度得到改善[27]，对羊的研究结果也可得到与此类似的结论[28]。g.12074C>A突变位点臂三头肌和腹外斜肌中CC基因型极显著高于CA基因型，该突变位点对伊犁马肉的嫩度会产生较大的影响，在对肉用马的选育过程中。研究中所检测出突变位点未能在部分部位中对所检测指标产生影响，可能是由于部位因素的影响，也可能是因为所检测样本量较少所致，在今后的研究中可加大样本量进一步加以验证。
在伊犁马LPL基因中共检测出g.715T>C和g.12074C>A两个突变位点，均为低度多态位点且为Hardy-Weinberg平衡状态。g.715T>C位点两种基因型臂三头肌失水率呈极显著差异，背阔肌、臀中肌失水率呈显著差异；
背阔肌、腹外斜肌中剪切力呈极显著差异，三角肌、臀中肌中剪切力呈显著差异。g.12074C>A位点两种基因型臂三头肌、臀中肌中失水率呈极显著差异，背阔肌、腹外斜肌中失水率呈显著差异；
臂三头肌中熟肉率呈极显著差异，三角肌、腹外斜肌中熟肉率呈显著差异；
臂三头肌、腹外斜肌中剪切力呈极显著差异。2个突变位点对伊犁马肉质会产生一定影响，是影响伊犁马肉质性状的可能候选功能基因位点。
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