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颜浩昆，王宇航，陈文飞，胡杨，熊善柏，荣建华
(华中农业大学 食品科学与技术学院，武汉 430070)
牛蛙(RanacatesbeianaShaw)，又称为美洲牛蛙，是蛙属中体型最大的蛙类之一[1]。它起源于北美东部，于20世纪50年代被引入中国进行水产养殖生产[2]。牛蛙肉洁白细嫩、味道鲜美、营养丰富，是一种高蛋白、低脂肪、低热量、低胆固醇的食品[3]。同时，牛蛙肉含多种微量营养元素，氨基酸种类齐全、含量丰富[4]。经烹饪制作成的美食味道鲜美，被广大消费者所喜爱。牛蛙宰杀后即便在冷藏条件下品质劣化依旧严重，不仅难以满足消费者的需求，更严重束缚了生鲜牛蛙制品市场化、规模化发展，因此如何有效改善冷藏期间牛蛙腿肉品质是目前牛蛙保鲜加工行业亟需攻克的难题。
复合磷酸盐对肉制品具有多种改良效果，可提高pH值，螯合肉中的金属离子，使肌纤维膨胀，肉的持水性提高，同时随着离子强度的增加，还可以保持肉的嫩度[5]。磷酸盐也具有抑菌作用，能够抑制某些革兰氏阳性细菌的生长繁殖[6]。海藻酸钠是从褐藻中获得的多糖，它由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸组成[7]。食品保鲜中经常使用海藻酸钠作为涂膜剂，因为它具有良好的生物降解性以及低毒性[8]，而且海藻酸钠涂料薄膜能屏障水和氧气，防止产品氧化并将水分含量保持在最佳水平，可以提高水产品的品质和保质期[9]。但目前关于两者联用鲜有报道，而且复合磷酸盐和海藻酸钠在水产品保鲜方面的研究主要集中于海水鱼、淡水鱼和虾类，对于牛蛙鲜有报道。故本实验以牛蛙为原料，探究复合磷酸盐和海藻酸钠对冷藏期间牛蛙腿肉理化品质、微生物、感官品质变化情况的影响，并借此探索冷藏牛蛙腿肉的可食用期限。
1.1 材料
牛蛙：规格(250±30) g，采购于武汉市白沙洲农副产品大市场。复合磷酸盐：湖北兴发化工有限公司；
食品级海藻酸钠：河南喜莱客化工产品有限公司。
1.2 试剂
氧化镁、硼酸、氯化钠、浓硫酸、浓盐酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
平板计数琼脂：海博生物技术有限公司。
1.3 主要仪器与设备
DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；
AUY220电子分析天平、TX2202L电子天平 岛津企业管理(中国)有限公司；
772S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；
DF-101S恒温加热磁力搅拌器 巩义市科瑞仪器有限公司；
HH-4数显恒温水浴锅 国华(常州)仪器制造有限公司；
KMF46S20TI冰箱 博世公司；
UltraScan VIS色差仪 美国Hunter Lab公司；
YSQ.SG.41280压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；
LRH-150B培养箱 广东省医疗器械厂；
HD-1360超净工作台 哈尔滨东联仪器公司；
818 pH计 ORINO公司；
TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司；
BL-8L-2电炸炉 宝康公司。
1.4 方法
1.4.1 保鲜液制备和样品处理
将一定质量复合磷酸盐溶解于一定质量水中制得2%(质量比)复合磷酸盐溶液。将一定质量海藻酸钠加入一定质量水中，在磁力搅拌器中65 ℃搅拌溶解，制得1.5%(质量比)海藻酸钠溶液。
挑选健康、体重在250 g左右的牛蛙。在宰杀前，对牛蛙进行低温麻醉，即将活牛蛙放置于38 L保温箱中2 h后取出，使牛蛙处于昏迷状态。将牛蛙宰杀后去除蛙蹼，剥离蛙皮，去除内脏，取脊椎尾部以下部位即为牛蛙腿，清洗干净后放在碎冰上备用。将牛蛙腿平均分为4组，分别为对照组、海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组。其中，对照组：牛蛙腿肉直接包装；
海藻酸钠组：将牛蛙腿肉置于1.5%海藻酸钠中浸泡5 min；
复合磷酸盐组：将牛蛙腿肉按料液比1∶3(质量比)于2%复合磷酸盐溶液中浸泡14 h；
浸泡涂膜联用组：将牛蛙腿肉按料液比1∶3(质量比)于2%复合磷酸盐溶液中浸泡14 h后再置于1.5%海藻酸钠溶液中浸泡5 min。将浸泡好的牛蛙腿肉放置于方筛中沥干，5 min后采用食品级自封袋密封包装。放置于4 ℃冰箱中贮藏0，1，2，3，4，5，6，7 d后取出，测定指标。其中0 d时样品为新鲜牛蛙腿肉，由于复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组处理时间较长，因此从第1天开始取样测定相关数据。
1.4.2 色差测定
室温下用UltraScan VIS型色差仪测定样品色差，仪器测量前使用标准白板校正。“L*”、 “a*”、“b*”表示颜色的坐标：“L*”表示样品的明度；
“+a*” 表示样品偏红，“-a*”表示样品偏绿；
“+b*”表示样品偏黄，“-b*”表示样品偏蓝。每次测试选取牛蛙大腿中部区域，左右两腿各测1次。
1.4.3 质构测定
室温下使用质构仪测定牛蛙腿肉的质构特性。将牛蛙腿肉腹面朝上水平放置在测试仪平台上，将牛蛙大腿内侧中部对准测试探头，探头测试部位应尽量远离腿骨。每次测试选择相同部位，牛蛙左、右腿各测试1次。选择全质构(TPA)模式，压缩比50%，测试探头为P 0.25S，测前速率为2 mm/s，测试速率为1 mm/s，测后速率为1 mm/s，触发力为5 g，测定间隔时间为5 s。TPA结果采用TPA-Macro分析，结果取平均值。
1.4.4 感官评价
将冷藏后的牛蛙腿肉取出清洗、切分、油炸70 s。由经过培训的6名感官评价员依次对油炸后牛蛙腿肉的色泽、气味、滋味、咀嚼性、口感进行感官评定，牛蛙腿肉感官评价标准见表1。
表1 牛蛙腿肉感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of bullfrog leg meat
续 表
1.4.5 pH测定
按GB 5009.237—2016测定牛蛙腿肉的pH值。
1.4.6 TVB-N测定
按GB 5009.228—2016测定牛蛙腿肉的TVB-N含量。
1.4.7 菌落总数测定
按GB 4789.2—2016测定牛蛙腿肉的菌落总数，菌落总数值用lg CFU/g表示。
1.4.8 数据分析
数据采用Excel软件进行制表，采用SPSS 24.0进行数据分析，采用Duncan检验进行显著性分析，P<0.05表示差异显著，采用Origin 2021软件作图。
2.1 浸泡涂膜联用对冷藏牛蛙腿肉色差的影响
色泽是水产品的重要质量指标之一，影响消费者对产品的可接受性和购买决策[10]。冷藏过程中各组牛蛙腿肉色差L*、a*、b*值变化情况见图1。
图1 各组牛蛙腿肉在冷藏过程中色差的变化Fig.1 Changes of color difference of bullfrog leg meat in each group during cold storage
在新鲜牛蛙腿肉中，对照组和海藻酸钠组L*值无显著性差异，表明浸泡海藻酸钠对新鲜牛蛙腿肉的亮度没有明显影响。贮藏后，对照组L*值先波动下降后趋于稳定，第7天时达到53.4，稍低于初始值且具有显著性差异(P<0.05)，表明对照组牛蛙腿肉在冷藏期间光泽度出现轻微降低。海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组L*值随着贮藏时间的延长先波动上升后趋于稳定，整体上呈稳定上升趋势，说明这3组牛蛙腿肉在冷藏期间亮度逐渐上升，具有光泽。L*值的变化一般与贮藏过程中肉样表面水分存在情况有关[11]，浸泡复合磷酸盐和海藻酸钠会使牛蛙表面形成水膜，且随着贮藏时间的延长，牛蛙腿肉内部的水分迁移至表面，造成亮度值上升[12]。第2天～第7天，对照组、海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组的L*值依次降低。可见复合磷酸盐和海藻酸钠可改变牛蛙腿肉L*值在冷藏期间的变化，不会使其下降反而使其上升，而且两者联合使用效果更佳。
a*值为红度值，其大小主要与肌红蛋白的颜色和氧化状态有关[13]。在整个贮藏期间，浸泡涂膜联用组a*值不断波动，贮藏结束时a*值为0.75，与第1天无显著性差异(P>0.05)，说明冷藏期间浸泡涂膜联用组红度无明显变化。其余3组a*值呈波动上升趋势，贮藏至第7天时，对照组、海藻酸钠组和复合磷酸盐组a*值分别达到4.06，3.21，1.77，均显著大于浸泡涂膜联用组，说明在冷藏期间该3组牛蛙腿肉红度增加，肌肉颜色逐渐变红且每组发红程度依次减弱。可见复合磷酸盐和海藻酸钠可以延缓冷藏过程中牛蛙腿肉a*值的增加，且两者联合使用效果更佳。
b*值为黄度值，与肉品氧化程度有关[14]。由图1可知，对照组和海藻酸钠组的b*值随着时间的延长整体呈现波动上升的趋势，说明冷藏期间两组牛蛙腿肉黄度逐渐增强，肌肉颜色逐渐发黄。复合磷酸盐组b*值不断波动，而浸泡涂膜联用组b*值先波动后趋于平缓。同时，冷藏期间复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组b*值显著低于其他两组，而海藻酸钠组仅在第5天和第6天时小于对照组，这表明浸泡复合磷酸盐可减缓冷藏期间牛蛙腿肉b*值变化，而浸泡海藻酸钠作用有限。未浸泡复合磷酸盐的牛蛙腿肉在冷藏过程中b*值出现较大幅度的增加，这可能是由于肉的氧化和细菌的大量繁殖[15]。复合磷酸盐可较大程度地抑制b*值的变化，这可能是由于复合磷酸盐可抑制肉的氧化和细菌的繁殖[16]。
2.2 浸泡涂膜联用对冷藏牛蛙腿肉pH的影响
冷藏期间各组牛蛙腿肉pH的变化情况见图2。
图2 各组牛蛙腿肉在冷藏过程中pH的变化Fig.2 Changes of pH of bullfrog leg meat in each group during cold storage
由图2可知，4组牛蛙腿肉的pH均呈现逐渐下降的趋势，这可能是由于ATP分解和肌糖原酵解，使乳酸不断产生并积累。新鲜牛蛙腿肉中对照组和海藻酸钠组的pH无显著性差异(P>0.05)，说明海藻酸钠对牛蛙腿肉的初始pH影响较小。在贮藏过程中复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组的pH均大于其他两组，这是由于复合磷酸盐溶液呈碱性，牛蛙腿肉在该溶液中浸泡后提高了其初始pH值，从而使牛蛙腿肉在整个贮藏期间保持较高的pH水平。冷藏中后期，海藻酸钠组pH略小于对照组，浸泡涂膜联用组pH略小于复合磷酸盐组，可见海藻酸钠会轻微加快冷藏中后期牛蛙腿肉pH的降低。
2.3 浸泡涂膜联用对冷藏牛蛙腿肉质构特性的影响
冷藏过程中各组牛蛙腿肉硬度和咀嚼性的变化情况见图3。
图3 各组牛蛙腿肉在冷藏过程中质构特性的变化Fig.3 Changes of texture properties of bullfrog leg meat in each group during cold storage
由图3可知，冷藏过程中4组牛蛙腿肉的硬度和咀嚼性均呈现出逐渐上升的趋势。前4 d对照组和海藻酸钠组牛蛙腿肉硬度均小于复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组。之后，复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组硬度和咀嚼性仍缓慢上升，而对照组和海藻酸钠组出现急剧上升，从而超过复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组。整体上来看，海藻酸钠组与对照组差异较小，复合磷酸盐组与浸泡涂膜联用组差异较小。综合以上情况，可见海藻酸钠对硬度和咀嚼性的影响较小，浸泡复合磷酸盐溶液会使牛蛙腿肉的硬度和咀嚼性增加，但可在冷藏后期较大程度上减缓硬度和咀嚼性的增加。
随着冷藏时间的延长，对照组、海藻酸钠组和浸泡涂膜联用组弹性呈现先波动下降后稳定的趋势，复合磷酸盐组弹性无显著变化，在0.75～0.78之间反复波动。前6 d对照组和海藻酸钠组弹性差异并不明显，第7天海藻酸钠组弹性显著小于对照组(P<0.05)，而在第1，2，7天，浸泡涂膜联用组弹性明显小于复合磷酸盐组，可见海藻酸钠对牛蛙腿肉弹性具有轻微的不利影响。第3天～第5天，浸泡涂膜联用组弹性明显高于对照组和海藻酸钠组，在冷藏期间复合磷酸盐组弹性整体上明显高于其他3组，这说明浸泡复合磷酸盐溶液可以提高牛蛙腿肉的弹性，并且在贮藏期间对牛蛙腿肉弹性有较好的保持作用。
冷藏期间，4组牛蛙腿肉内聚性整体上呈现先下降后稳定的趋势，对照组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组内聚性无明显差异，而且该3组内聚性基本上均大于海藻酸钠组。可见尽管单独浸泡海藻酸钠后会对冷藏时牛蛙腿肉的内聚性产生不利影响，但是复合磷酸盐的单独使用以及和海藻酸钠联合使用对冷藏期间牛蛙腿肉的内聚性无明显影响。
冷藏期间，各组牛蛙腿肉回复性呈先下降后稳定的趋势。前4 d，复合磷酸盐组和对照组牛蛙腿肉回复性基本上无明显差异。随后，复合磷酸盐组回复性明显高于对照组。可见单独浸泡复合磷酸盐溶液可在一定程度上延缓牛蛙腿肉冷藏期间回复性的变化。在贮藏期间，浸泡涂膜联用组回复性与对照组差异较小，海藻酸钠组回复性整体水平差于对照组，可见海藻酸钠单独使用会对冷藏时牛蛙腿肉的回复性产生不利影响，但是海藻酸钠和复合磷酸盐联合使用对冷藏期间牛蛙腿肉的内聚性无明显影响。
2.4 浸泡涂膜联用对冷藏牛蛙腿肉TVB-N的影响
挥发性盐基氮(TVB-N)是指贮藏时蛋白质在内源酶和细菌的共同作用下分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，是水产品鲜度的评价指标[17]。4组牛蛙腿肉在冷藏过程中TVB-N的变化情况见图4。
图4 各组牛蛙腿肉在冷藏过程中TVB-N的变化Fig.4 Changes of TVB-N of bullfrog leg meat in each group during cold storage
在新鲜牛蛙腿肉中，对照组和海藻酸钠组的TVB-N含量无显著差异，略高于3 mg/100 g。第1天对照组TVB-N显著高于其余3组，该3组牛蛙腿肉无明显差异(P>0.05)。之后随着贮藏时间延长，各组TVB-N含量逐渐上升。该现象是肌肉内源酶和细菌在贮藏期间不断分解蛋白质产生氨及胺类含氮挥发性物质而引起的[18]。贮藏过程中各组牛蛙腿肉TVB-N含量虽然有所增加，但仍然符合冷鲜肉挥发性盐基氮的一级鲜度标准(≤15 mg/100 g)[19]。对照组TVB-N含量上升速度最快，在贮藏结束时达到10.85 mg/100 g，几乎为初始值的4倍。相较于对照组，海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组在贮藏结束时TVB-N含量分别降低约24%、25%、25%。可见单独使用海藻酸钠可抑制牛蛙腿肉TVB-N的积累，复合磷酸盐单独或者与海藻酸钠联合使用效果更佳，这可能与海藻酸钠和复合磷酸盐的抑菌作用有关[20-21]。
2.5 浸泡涂膜联用对冷藏牛蛙腿肉菌落总数的影响
菌落总数是衡量贮藏期间水产品品质与腐败程度的重要指标[22]，一般认为6 lg CFU/g是生鲜水产品的菌落总数上限[23]。4组牛蛙腿肉在冷藏过程中菌落总数的变化情况见图5。
图5 各组牛蛙腿肉在冷藏过程中菌落总数的变化Fig.5 Changes of total number of colonies of bullfrog leg meat in each group during cold storage
4组牛蛙腿肉菌落总数随着时间延长均逐渐上升，对照组、海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组增加速度依次递减。显然，海藻酸钠可减缓牛蛙腿肉在冷藏期间菌落总数的变化，但复合磷酸盐作用更强，且两者联合使用效果最佳。可见海藻酸钠和复合磷酸盐都具有抑菌作用，在冷藏期间可以抑制微生物的繁殖。王灵昭等[24]发现复合磷酸盐可抑制沙光鱼片微生物的繁殖，邢晓亮等[25]发现海藻酸钠也可抑制冰温大黄鱼细菌的生长。
新鲜牛蛙腿肉的菌落总数为3.30 lg CFU/g。之后对照组菌落总数持续增加。贮藏至第4天时菌落总数为5.85 lg CFU/g，接近可食用上限。第5天菌落总数为6.79 lg CFU/g，远超可食用上限。海藻酸钠组和复合磷酸盐组分别在第5天和第6天达到5.79，5.41 lg CFU/g，即将达到可食用上限，分别在第6天和第7天达到6.76，6.51 lg CFU/g，超过可食用上限。浸泡涂膜联用组在第7天达到5.79 lg CFU/g，接近可食用上限；
显而易见，以菌落总数为评价标准，对照组、海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组的可食用期限分别为4，5，6，7 d。
2.6 浸泡涂膜联用对冷藏牛蛙腿肉感官品质的影响
感官评价是通过人的感官来感受食品的品质，可以直接反映消费者对于冷藏牛蛙腿肉的接受程度[26]。4组牛蛙腿肉在冷藏过程中感官评分的变化情况见表2。
表2 各组牛蛙腿肉在冷藏过程中感官评分的变化Table 2 Changes of sensory score of bullfrog leg meat in each group during cold storage
续 表
在冷藏过程中，各组牛蛙腿肉油炸后气味评分变化不大，而且各组之间均无显著差异。可见贮藏时间对冷藏牛蛙腿肉油炸后的气味无明显影响，而且海藻酸钠和复合磷酸盐对此也无明显影响。各组牛蛙腿肉色泽评分没有明显差异，随着贮藏时间的延长，冷藏牛蛙腿肉色泽评分逐渐降低，具体表现为牛蛙油炸后的颜色逐渐从一开始均匀的淡黄色逐渐加深变为黄褐色。前6 d，对照组和海藻酸钠组的滋味评分无明显差异，第7天，对照组滋味评分明显低于海藻酸钠组，可见海藻酸钠可延缓牛蛙腿肉后期的滋味下降，但效果十分有限。在整个贮藏期间，复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组无明显差异，该两组牛蛙腿肉滋味评分在4 d之前明显低于对照组，4 d以后明显高于对照组。这可能是浸泡复合磷酸盐会降低牛蛙腿肉中鲜味物质的含量，如呈味氨基酸等，因此在贮藏前期滋味低于未浸泡的牛蛙腿肉，但贮藏后期由于对照组牛蛙腿肉滋味下降严重，因此贮藏后期复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组滋味高于未浸泡的牛蛙腿肉，可见复合磷酸盐可较好地保持冷藏牛蛙腿肉的滋味。
口感代表牛蛙腿肉油炸以后入口的软硬程度，咀嚼性代表牛蛙腿肉油炸以后入口咀嚼的难易程度，本评价方法中设置5分为消费者可接受上限。由表2可知，口感评分和咀嚼性评分以及感官总分的下降速度由快到慢依次为对照组、海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组，其中各组咀嚼性评分的下降幅度大于口感评分下降幅度。在第7天时对照组、海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组牛蛙腿肉的口感评分依次为4.83，5.73，6.28，6.60，只有对照组达到限值；
而各组咀嚼性评分依次在第5，6，6，7天时达到4.95，4.75，5.05，4.95，此时牛蛙腿肉咀嚼费力，肌肉纤维难以嚼断。
综上所述，海藻酸钠和复合磷酸盐可以延缓牛蛙腿肉在冷藏期间感官品质的劣变，两者联用作用更强。以感官评分为评价标准，对照组、海藻酸钠组、复合磷酸盐组和浸泡涂膜联用组的可食用期限应该为4，5，5，6 d。
以牛蛙为原料，研究了牛蛙腿肉在冷藏过程中品质的变化规律以及复合磷酸盐和海藻酸钠浸泡涂膜联用对牛蛙腿肉冷藏期间品质的影响。结果表明，复合磷酸盐和海藻酸钠单独使用均可延缓冷藏期间牛蛙腿肉的色泽、感官品质、菌落总数和TVB-N值的变化，且两者联合使用作用更强。复合磷酸盐可显著提高牛蛙在冷藏期间的pH，而海藻酸钠无明显影响。复合磷酸盐和海藻酸钠联合使用可以消除海藻酸钠对质构的不利影响。不同方法处理对冷藏牛蛙腿肉的可食用期限有显著的延长效果，其中海藻酸钠处理延长1 d，复合磷酸盐处理延长1～2 d，复合磷酸盐和海藻酸钠浸泡涂膜联用延长2～3 d。
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