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马艳红，刁玉华，万 静
(昆明市食品药品检验所 食品检验中心，云南 昆明 650010)
甲醇，又称木醇、羟基甲烷，是无色透明、易挥发的液体，沸点 64.7 ℃，对人体有害，容易在体内蓄积并损伤多处器官[1]。甲醇毒性作用主要是由甲醇本身及代谢产物(甲醛和甲酸)引起的，以中枢神经系统损伤、代谢性酸中毒及眼部损伤为主，人摄入甲醇5～10 mL 可致严重中毒，7～15 mL 以上可致失明，30 mL 以上可致死亡[2-3]。由于原料的植物细胞壁及细胞间质含有果胶，在酒的酿造过程中不可避免有甲醇的产生，特别是，果胶含量较大的粮谷和水果受热或在酶的作用下分解产生的甲醇含量更高[4-5]。通常，虽然酒中含有微量的甲醇是正常的，但是由于一些生产者酿造工艺技术的不完善或不良商家人为掺假、制售假酒等造成酒中甲醇超标，严重危害广大消费者的生命安全[6]。GB 2757-2012《食品安全国家标准 蒸馏酒及其配制酒》规定了甲醇在酒类样品中的最大残留限量，粮谷类和其他类蒸馏酒的配制酒最大残留限量分别为 0.6 g/L 和 2.0 g/L[7]。GB/T 15037-2006《葡萄酒》也特别说明了白、桃红葡萄酒和红葡萄酒中甲醇的最大残留限量分别为 250 mg/L 和 400 mg/L[8]。
目前，对酒中甲醇的检测方法主要有气相色谱法[9-14]、气相色谱-质谱联用法[15-17]、比色法和分光光度计法[18-19]。气相色谱法具有较高的灵敏度、较好的稳定性、极高的准确性，因而已成为酒中甲醇检测的最主要方法。我国于2017年6月23日实施的GB 5009.266-2016《食品安全国家标准 食品中甲醇的测定》就是采用配置FID检测器的气相色谱法对酒精、蒸馏酒、配制酒及发酵酒中甲醇的测定[20]。其中，酒精、蒸馏酒及其配制酒直接取样测定，但发酵酒及其配制酒还需进行蒸馏处理,去除可能污染仪器和色谱柱的营养成分、微量元素及色素等，例如葡萄酒。在长期使用标准检测的过程中发现，许多酱香型白酒由于成分比其它白酒复杂，造成在检测时甲醇峰较难完整、清晰地分离开，严重影响定量的准确性。本实验旨在通过比较静态顶空和直接进样法探究酒中甲醇的测定,静态顶空法一方面可以高效处理样品，发酵酒及其配制酒无需进行蒸馏，减轻前处理负担并有效避免蒸馏过程中甲醇的损失；
另一方面，对较难分离出良好甲醇峰形的酱香型白酒，可以得到分离完好、清晰的甲醇峰，增强定量的准确性。
1.1 材料
标准品：φ(甲醇)≥ 99.7%，CAS 67-56-1，DR EHRENSTORFER。试剂：φ(乙醇)≥99.8%，色谱纯，Fisher Chmical；
超纯水。白酒质控样品：QC-DL-702，中国检验检疫科学研究院测试评价中心；
红酒质控样品：FD192-QC，LGC；
市售酱香型白酒3份，普通白酒2份(清香型白酒和高粱酒)，白葡萄酒2份，红葡萄酒2份。
1.2 仪器设备
气相色谱仪(配FID检测器)，岛津GC-2010Plus；
顶空进样器，岛津HS-20；
十万分之一电子天平，美国梅特勒托利多公司；
旋涡混合器 海门其林贝尔公司；
超纯水制备器，赛多利斯。
1.3 方法
外标法定量[测定结果均按酒精度100%(体积分数)计算]。
1.3.1 溶液配置
40%乙醇水溶液：准确移取 200 mL 无水乙醇至 500 mL 容量瓶，用超纯水定容至刻度线，混匀待用。
1.3.2 顶空进样法
1.3.2.1 标准工作溶液
准确称取 25.30 mg 甲醇标准品于 25 mL 容量瓶，用40%乙醇水溶液定容至刻度线并混匀，得 1.012 mg/mL 甲醇储备液。再用40%乙醇水溶液将储备液依次稀释为 5.06、10.12、50.6、101.2、253.0、506.0、809.6 μg/mL 的系列标准工作溶液，并各准确移取 5 mL 至 20 mL 顶空进样瓶中，压紧瓶盖密封、混匀。
1.3.2.2 样品前处理
通过事先模拟顶空恒温状态，将装有 5 mL 红酒的顶空瓶在 70 ℃ 下恒温 20 min，移出瓶内蒸汽再经冷却后，冷凝液无色透明，污染物减少，说明对于红酒顶空进样无须进行蒸馏。所以室温下混合均匀样品，从中准确移取 5 mL 至 20 mL 顶空进样瓶，压紧瓶盖密封，待上机测定。
1.3.2.3 气相色谱条件
色谱柱：聚乙二醇石英毛细管柱 DB-WAX UI(60 m×0.250 mm×0.25 μm)；
程序升温：初始温度 40 ℃ 保持 5 min，以 3 ℃/min 升至 70 ℃ 不保持，再以 30 ℃/min 升至 230 ℃ 保持 2 min；
检测器温度：250 ℃，氢气流量 40.0 mL/min，空气流量 400.0 mL/min，载气：高纯氮气(φ≥99.999%)；
进样器：恒温炉温度为 70.0 ℃，样品流路温度为 100.0 ℃，传输线温度为 120.0 ℃，样品恒温时间为 20.0 min，样品加压时间 1.0 min，加压平衡时间 0.1 min，进样时间 0.5 min，GC循环时间 32.0 min，分流比为50∶1，色谱柱流量 1.2 mL/min。
1.3.3 全自动直接进样法
1.3.3.1 标准工作溶液
准确称取 25.04 mg 甲醇标准品于 25 mL 容量瓶，用40%乙醇水溶液定容至刻度线并混匀，得 1.0016 mg/mL 甲醇储备液。再用40%乙醇水溶液将储备液依次稀释为 5.008、10.016、50.08、100.16、250.40、500.80、801.28 μg/mL 的系列标准工作溶液，混匀。
1.3.3.2 样品前处理
室温下混合均匀样品，澄清试样过 0.45 μm 滤膜后混匀，移取 1 mL 至进样小瓶；
颜色较深试样经蒸馏(按GB 5009.266-2016标准方法操作)后混匀，过 0.45 μm 滤膜并移取 1 mL 至进样小瓶，待上机测定。
1.3.3.3 气相色谱条件
进样器：全自动进样，进样口温度为 220 ℃，进样量为 0.5 μL，分流比为20∶1，色谱柱流量 1.2 mL/min。色谱柱、检测器、程序升温条件同1.3.2.3。
2.1 色谱柱的选择
由于甲醇和40%乙醇水溶液极性较大，根据色谱柱的使用规则及相似相溶原理，选择WAX型的聚乙二醇石英毛细管极性色谱柱，确保甲醇有足够的灵敏度和分离能力。使用WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)两种色谱柱测定甲醇，通过减少进样量、降低初始温度、延长低温保持时间、降低色谱柱流量、减慢升温速率等操作均难以和溶剂乙醇峰分开，不利于定量分析。采用 60 m 长的色谱柱DB-WAX UI(60 m×0.250 mm×0.25 μm)增强分离效能，达到甲醇峰完整、清晰地分离开，峰形尖锐、对称，可进行准确地定性定量分析，所以本实验选择 60 m 长的极性色谱柱(见图1)。
图1 三种不同长度色谱柱的甲醇色谱图
2.2 气相色谱条件优化
首先，按照GB 5009.266-2016标准给定的仪器参考条件设为方法一：全自动进样，进样量为 1 μL；
进样口温度为 220 ℃，分流比为20∶1，载气流量 1.0 mL/min；
检测器温度为 250 ℃；
程序升温：初始温度 40 ℃ 保持 1 min，以 4 ℃/min 升至 130 ℃ 不保持，再以 20 ℃/min 升至 200 ℃ 保持 5 min。该方法均没能实现白酒中甲醇的分离，红酒中甲醇出峰均拖尾严重。接着设置方法二：把进样量改为 0.5 μL，其余条件同方法一。该方法对红酒和大多数白酒中甲醇分离良好，能满足基本定性定量要求，但是对酱香型白酒依然实现不了甲醇分离。最后优化得方法三：进样量为 0.5 μL，载气流量 1.2 mL/min，程序升温：初始温度 40 ℃ 保持 5 min，以 3 ℃/min 升至 70 ℃ 不保持，再以 30 ℃/min 升至 230 ℃ 保持 2 min，其余条件同方法一。该方法可实现红酒和所有白酒中甲醇的分离，出峰不与其它组分重叠，而且适当提高载气流量起到了改善拖尾的效果，三个方法分离情况见图2。因此，这里选择方法三作为全自动进样的色谱条件。
图2 同一酱香型白酒在直接进样三种方法中甲醇出峰情况
同理，顶空进样量也不宜过大。本实验通过控制进样时间 0.5 min 并增大分流比至50∶1来控制低进样量。控制已优化顶空进样器条件不变，分别设置方法四、方法五、方法六。方法四按方法一检测器、程序升温、载气流量条件设置，该方法不能有效分离出甲醇峰。方法五检测器、程序升温条件同方法三，载气流量 0.8 mL/min，该方法对酱香型白酒依然不能使甲醇完整清晰地分离开。方法六检测器、程序升温条件同方法三，载气流量 1.2 mL/min，该方法适当提高载气流量，可实现红酒和全部白酒中甲醇的分离，特别是上述甲醇未分离开的酱香型白酒，甲醇出峰完整、尖锐、对称。三个方法分离情况见图3。因此，这里选择方法六作为顶空进样的色谱条件。
图3 同一酱香型白酒在顶空进样三种方法中甲醇出峰情况
2.3 顶空平衡条件的探究
本实验主要探究顶空进样中平衡温度、平衡时间对顶空进样时的影响，并选择最优条件进行试验。
2.3.1 平衡温度
对于顶空进样，提高样品瓶的温度，有利于降低待测物在瓶内的分配系数，增大待测物在瓶内气相中的浓度，从而增加顶空分析的灵敏度。但是该温度也应低于溶剂沸点，不能引起溶剂沸腾并避免顶空瓶胀裂胀破。根据甲醇沸点 64.7 ℃，溶剂和样品主要为乙醇水溶的特点，本实验选择对60、64.7、70、75、80 ℃ 5个温度进行探究对比。试样和其它条件保持一致，同一试样中甲醇响应值均随温度升高而增大，再结合甲醇峰分离情况来看，70 ℃ 时分离情况最好。特别是酱香型白酒，75 ℃ 和 80 ℃ 时甲醇峰不能和甲醇之后的其它组分峰有效、完全分离开(见图4)。所以综合考虑，选择 70 ℃ 作为平衡恒温时间，即达到了足够的灵敏度，又能实现甲醇良好地分离。
图4 同一酱香型白酒不同平衡温度下甲醇出峰情况
2.3.2 平衡时间
控制顶空平衡温度为 70 ℃，对同一均匀试样在平衡时间为 10、15、20、25、30、40 min 下各进行3次平行测试，结果是当时间增加至 20 min 时，甲醇已达到最大响应，继续延长平衡时间甲醇响应已不再发生明显变化(见图5)，同时6个恒温时间下，甲醇峰分离均完整且不与前后峰交叠。所以本实验选择 20 min 作为顶空进样的平衡时间。
图5 同一试样平衡时间与响应值之间关系
2.4 数据结果分析与比较
2.4.1 标准曲线
将1.3.2.1配制的标准工作溶液按1.3.2.2条件通过静态顶空进样；
将1.3.3.1配制的标准工作溶液按1.3.3.2条件通过直接进样，分别得到两种进样测定的甲醇标准溶液峰面积数据，并绘制得两种进样方式的标准曲线，结果见表1、图6、图7。质量浓度范围覆盖3个级别，包含7个点，相关系数大于0.99，均满足GB/T 27404-2008要求。顶空进样达到与全自动直接进样一致的良好线性，满足准确定量的要求。
表1 标准曲线线性关系
图6 顶空进样标准曲线 图7 直接进样标准曲线
2.4.2 加标回收率
根据所配置的甲醇标准储备液，选择低度数的普通白酒作为加标试样，对顶空进样和直接进样分别进行4个不同质量浓度的进样，依次测定并计算其加标回收率，数据和结果见表2。顶空进样回收率为95.12%～100.92%，直接进样回收率为99.54%～102.62%，两种进样方式都取得较好的加标回收率，满足GB/T 27404-2008对回收率的要求。因此静态顶空进样同样可准确进行酒中甲醇的测定和质量控制。
表2 顶空进样和直接进样回收率结果
2.4.3 精密度
顶空进样和直接进样分别对每个质量浓度重复测定6次，计算得各相对标准偏差见表3。顶空进样RSD值为0.277%～0.511%，直接进样RSD值为0.127%～0.338%，两种进样方式都取得较好的精密度，满足GB/T 27404-2008对精密度的要求。静态顶空进样同样取得较小的偏差，可进行酒中甲醇的准确测定。
表3 顶空进样和直接进样精密度测试结果
2.4.4 测定低限
根据所配甲醇储备液，直接进样对加标量为 5.008 μg/mL 的6个加标试样连续进样，平均加标回收率为101.018%，相对标准偏差为1.825%。顶空进样对加标量为 5.06 μg/mL 的6个加标试样连续进样，平均加标回收率为94.097%，相对标准偏差为2.239%。两种进样方式加标回收率高且稳定，相对标准偏差较小，精密度较高，因此以 5 μg/mL 作为酒中甲醇测定的定量限。
2.4.5 准确度
顶空进样和直接进样分别对白酒和红酒两种质控样品进行测定，测定结果和误差见表4。对白酒质控样品，顶空进样和直接进样测定结果都较接近特性值，并都取得了较高准确度。对红酒质控样品，顶空进样测定结果相对高于直接进样，准确度相对比直接进样更高，绝对误差更小。因此，静态顶空进样对酒中甲醇的测定效果良好，特别是，对于红酒不经蒸馏可直接吸取原样进行进样测定，在一定程度上避免了因蒸馏造成甲醇的损失，可靠性比直接进样高。
表4 顶空进样和直接进样对质控样品测定的结果
2.4.6 样品测定结果
顶空进样和直接进样分别对市售2份白葡萄酒、2份红葡萄酒、1份高粱白酒、1份清香型白酒、3份酱香型白酒中甲醇进行测定，同一试样采用双样连续两次进样，测定结果平均值见表5。从表5来看，通过顶空进样测得葡萄酒的甲醇含量，特别是红葡萄酒，明显比蒸馏后全自动直接进样测得的甲醇含量高。这说明顶空进样法测定葡萄酒比直接进样法具有更高可靠性，直接移取原样测定，在一定程度上避免了因蒸馏、冷却等前处理过程造成甲醇的损失。从甲醇出峰来看，两种进样方式甲醇峰形都较好且无干扰。高粱白酒两种进样方法测得绝对差值比上算术平均值1.602%<10%、清香型白酒两种进样方法测得绝对差值比上算术平均值0.161%<10%。可见，对于普通白酒，两种进样方法结果偏差较小，而且两种进样方式甲醇峰形都较好且无干扰，所以两种进样方式皆适宜普通白酒甲醇的测定。对于酱香型白酒(以本实验所选用的3种为例)，通过顶空进样法测得甲醇色谱峰尖锐、对称，无拖尾，可进行准确定性定量分析(见图8)。通过直接进样，在经过一系列色谱条件优化后，虽然使甲醇峰得到了有效的分离，但是均出现了严重的拖尾(见图9)。通过软件自动积分，由于包含了拖尾部分，定量计算得甲醇含量值明显高于顶空进样法测得值；
通过手动积分，去除拖尾部分，得到甲醇含量值与顶空进样法测得值保持一致，偏差较小。说明对于甲醇峰难分离的酱香型白酒选择静态顶空法更合适，特别是需要准确定量分析甲醇的时候。综上，选择静态顶空进样法测定酒中甲醇含量比全自动直接进样法更简化、准确。
表5 顶空进样和直接进样分别对不同试样测定结果
图8 3种酱香型白酒顶空进样的甲醇色谱峰
图9 3种酱香型白酒直接进样的甲醇色谱峰自动积分与手动积分
2.5 仪器比对验证
采用赛默飞科技世尔的顶空-气相色谱仪(顶空进样器型号：TRIPLUS 300；
气相色谱仪型号：TRACE 1310)；
色谱柱：TG-WAX MS 60 m×0.250 mm×0.25 μm)，对酒中甲醇通过静态顶空进样和全自动直接进样测定进行仪器对比验证。①方法：进样口温度、程序升温与检测器温度保持与上述岛津的一致，依然须控制低进样量才能使目标峰完整、良好地分离开。对于直接进样，本实验选择分流比20∶1，进样量 0.4 μL，载气流量 1.2 mL/min 效果最佳；
对于顶空进样平衡温度、时间与上述岛津的一致，由于仪器本身存在的差异，这里选择进样量 1 mL，分流比100∶1，载气流量 1.0 mL/min 效果最佳。②数据结果：两种进样方式都得到了较好的标准曲线，本实验重点对比了两台不同厂家仪器和不同色谱柱对几种红酒和3种酱香型白酒中甲醇测定的结果。对于红酒，两种进样方式甲醇出峰良好，顶空进样测得甲醇含量比蒸馏后直接进样测得的甲醇含量高，与使用岛津气相色谱仪测得结果一致；
对于3种酱香型白酒，直接进样方式在优化保证甲醇峰分离开的前提下，得到的甲醇峰依然拖尾严重，而顶空进样法得到的甲醇峰分离良好，测得结果与使用岛津气相色谱仪测得结果一致。
本方法采用静态顶空进样与全自动直接进样两种方式对不同酒中甲醇含量的测定比较，通过对色谱柱的选择、色谱条件的优化、顶空进样条件的确定、标准曲线、样品加标回收率、红酒和白酒质控样品准确度、方法精密度、不同样品酒中甲醇测定结果等方面进行探究和对比。采用顶空进样法改进酒中甲醇的测定，标准曲线线性相关系数较高，样品加标回收率和精密度高，且符合GB/T 27404-2008。在样品的测定中，一方面减少了GB 5009.266-2016《食品安全国家标准 食品中甲醇的测定》中颜色较深的发酵酒及其配制酒前处理蒸馏、定容等繁琐过程，避免了因蒸馏造成的甲醇损失，同时也减少了对色谱的污染；
另一方面对于甲醇难分离的酱香型白酒，顶空进样甲醇峰分离效果比直接进样分离更好，体现在峰形完整良好上，定性定量更准确，而且顶空进样也适用其它型白酒中甲醇的测定并取得较好结果。另外，由于顶空进样直接取样装瓶上机，前处理过程简单、快捷，适合批量检测。所以，静态顶空-气相色谱法可适用于高效、准确地检测各类酒中甲醇含量，特别是对于红酒和酱香型白酒更是优势明显，准确可靠。
