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程心璇 综述 刘祖国 廖怿 审校
厦门大学医学院 厦门大学眼科研究所 福建省眼科与视觉科学重点实验室 福建省眼再生医学工程研究中心，厦门 361000 程心璇现在南京大学医学院附属鼓楼医院，南京 210008
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是造成老年人不可逆视力损伤的重要原因，2040年全球AMD患者预计将增至2.88亿[1]。AMD的临床分型可以分为早期非渗出性(干性)AMD、晚期非渗出性(萎缩性)AMD和渗出性或新生血管性(湿性)AMD[2]。干性AMD患者视力退化不明显，表现为玻璃膜疣(drusen)和/或黄斑处的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)改变[2]。其中，drusen是含有多种脂类和蛋白质的细胞外沉积物，可能导致RPE功能受损及RPE与脉络膜之间物质代谢转运障碍[3-5]。干性AMD进展至晚期出现萎缩性AMD，表现为视力盲点和区域性RPE和下方感光细胞的缺失死亡，又称为地图样萎缩(geographic atrophy,GA)[2]。少数干性AMD患者在晚期转变为湿性AMD，表现为脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)[2]。作为一种受到遗传、代谢及营养等多因素影响的疾病，慢性炎症反应是促进AMD发生和发展的关键因素[6]。近年来，大量研究表明补体参与AMD的病理过程，补体过度激活导致的免疫损伤加速AMD进程。因此，充分认识AMD病程中补体的致病机制，并进一步开发有针对性的补体药物，对AMD的治疗具有积极的意义。
补体系统是体液免疫系统的组成部分，参与机体炎症反应、细胞调理和细胞溶解。补体系统由经典途径、替代途径和凝集素途径三大途径激活，通过形成C3、C5转化酶而启动一系列丝氨酸蛋白酶的级联酶解反应，最终生成攻膜复合物(membrane attack complex,MAC)裂解细胞。补体系统的激活受补体调节蛋白(complement regulatory protein,CRP)严格调控。CRP包括膜结合CRP和溶解性CRP。膜结合CRP主要包括膜辅蛋白、衰变加速因子、补体受体1和膜反应性溶解抑制因子。溶解性CRP主要包括CFH、CFB、CFI、C1抑制因子和C4结合蛋白。在视网膜中，已有的研究发现这些补体成分主要来源于视网膜小胶质细胞和RPE细胞[7]。
补体在眼部免疫赦免中起到关键作用。生理条件下，眼部C3自发水解使补体始终处于低水平的持续活化状态。低水平的补体激活对于维持眼部的免疫耐受和抑制迟发性超敏反应起到重要作用。同时，恒定的低水平补体活性对于免疫监视是必需的，可用于预防病原微生物的入侵以及感染[8]。另一方面，眼通过表达大量补体调节蛋白避免补体过度活化造成眼部损害[8]。也有研究表明，作为炎症反应的一部分而产生的补体激活产物可通过促进吞噬和清除细胞碎片而产生有益作用[9]。但不可否认，补体异常造成视网膜损害，视网膜相关补体激活与抑制之间的平衡与AMD的发病机理密切相关[10]。
遗传学研究已经证实了大量与AMD相关的补体基因遗传变异。在AMD遗传研究中最早发现CFH(Tyr402His)遗传变异与AMD高度相关[11-13]。CFH是一种广泛存在于血清中的替代途径调节蛋白，通过与CFB竞争结合C3b从而抑制C3转化酶的形成，抑制C3的激活。更进一步的研究揭示了CFH变体在AMD中的作用。CFH的Tyr402His突变存在于蛋白的第7个短同源重复序列内。Calippe等[14]的研究显示，该突变减缓视网膜内单核吞噬细胞(如小胶质细胞等)的清除速率，从而加速AMD的进程[14]。Rickman研究小组提出，该单核苷酸多态性改变了CFH与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的结合，导致Bruch膜中脂蛋白及drusen累积[15]。Chirco等[16]研究发现，Y402H多态性与RPE/脉络膜中的MAC显著增加相关，但并不影响循环中的MAC水平[16]。此外，大规模的遗传学分析也鉴定发现了其他与AMD相关的CFH多态性[17]。
补体相关的C2、C3、C9、CFI、CFB、VTN、CFHR1-CFHR3等基因遗传变异也被发现与AMD的发生相关[18-23]。Fritsche等[22]确定了与AMD相关的遗传突变分布在34个位点，涉及52个独立相关的常见和罕见变异体，52个变异体中常见的有45个，其余为罕见变异，包括CFH∶ Arg1210Cys、CFI∶ Gly119Arg、C9∶ Pro167Ser和C3∶ Lys155Gln以及CFH∶ rs148553336、rs191281603和rs35292876。对既往的大规模遗传学研究总结也发现，补体基因CFH、C2/CFB、C3和CFI附近的常见遗传变异，即在群体中具有>5%的次要等位基因频率(minor allele frequency,MAF)可以解释约57%的疾病风险，充分提示补体在AMD发生和发展中的关键作用[24]。有假设认为，低频和罕见的遗传变异(MAF分别<1%～5%和<1%)可能可以解释剩余的遗传部分，但也提示除补体外的其他机制在AMD中的作用[24]。CFI可将C3b和C4b转变为其无活性形式以减少C3和C5转化酶的形成，CFI的罕见变体降低血清CFI水平，从而降低其对C3b的降解能力，使其抑制补体激活的能力减弱。C9参与MAC形成，具有C9 Pro167Ser变体的个体与非携带者相比血清C9浓度升高，补体激活增强[25]。因此，这些罕见遗传变异使患AMD的风险增加数倍。
3.1 补体异常与Bruch膜改变
Bruch膜由位于RPE和脉络膜毛细血管床之间5层有序的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组成，包括RPE基底层、内胶原层、弹性蛋白层、外胶原层和脉络膜毛细血管基底层[4]。ECM成分紊乱导致Bruch膜不断增厚，随着胶原无序累积和弹力蛋白的减少，Bruch膜的物质运输能力也不断降低[4]。在AMD发展过程中，RPE与Bruch膜之间的ECM基底层沉积早于drusen出现，进而影响Bruch膜[26]。Fernandez-Godino等[27]研究表明，异常的ECM及AMD患者的Bruch膜结合活化的补体因子C3，从而长期激活补体替代途径。同时，Bruch膜的改变会导致RPE功能受损并促进AMD的发展[26]。Bruch膜对补体蛋白的渗透性具有明显的选择性，其中仅有FHL-1、CFD和C5a可以自由扩散，在Bruch膜任一侧或在源自循环的脉络膜侧局部合成的补体蛋白主要保留在其生成的一侧[28]。因此，对补体靶向治疗剂的设计需要考虑适当的递送水平以及Bruch膜的递送侧[28]。
3.2 补体异常与drusen
随年龄增长，drusen积聚在RPE与Bruch膜之间。Drusen是公认的AMD标志性病变，黄斑drusen是AMD进展为晚期疾病的主要风险因素[15]。drusen会破坏Bruch膜中营养物质和细胞废物的运输流动，最终导致细胞死亡，这种细胞死亡是AMD进展为晚期形式GA的原因[28]。drusen含有多种脂类、多糖、黏多糖和蛋白质，已有大量研究证实drusen中含有补体激活剂、抑制剂、激活的特异性补体片段和补体活化产物。蛋白质组学分析显示，drusen累积多种补体成分，包括CFH、CFB、C3、C5、C6、C7、C8、C9和MAC等[29]。
最新的遗传学家系研究表明，补体在drusen形成中具有重要作用。CFH的变体因子H-1(FH-like protein 1，FHL-1)保留了与FH相同的补体替代途径调节功能。在FH罕见的有害突变中，导致FH和FHL-1单倍剂量不足的突变是导致早发性黄斑drusen(early-onset macular drusen，EOMD)的重要病因[30]。Landowski等[31]采用转基因动物模型在Cfh-/-小鼠中表达人源性CFHY402和与AMD风险相关的CFHH402，发现CFH变体在AMD中的作用可能并不限于补体激活，而主要在维持外视网膜脂质稳态中发挥重要功能。在喂食高脂高胆固醇的老年小鼠模型中，Y402H多态性影响RPE衍生的脂蛋白，这些脂蛋白在Bruch膜中积累氧化，形成更多的RPE基底层沉积，这可能是致病性drusen和AMD形成的原因。
3.3 补体异常与视网膜炎症
炎症在AMD发生和发展中起到重要作用。作为机体天然免疫的重要组分，补体失调与AMD中的慢性炎症关系密切。补体成分作为可溶性模式识别分子激活复杂的细胞内信号转导途径从而产生促炎性介质[32]。研究显示，C3a和C5a等补体成分在视网膜中诱发炎症因子的释放[7]。Asgari等[33]研究表明，C3a可以通过刺激ATP释放和激活NLRP3炎性小体来促进人单核细胞中的炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的分泌。另一过敏毒素C5a也可以作为启动信号激活RPE细胞炎性小体以促进IL-1β分泌[34]。Brandstetter等[35]研究指出，C5a可以启动RPE细胞中的炎性小体，使细胞死亡方式从凋亡转变为焦亡，增加了光氧化介导细胞死亡的易感性。过度激活导致免疫细胞趋化聚集和炎症因子释放，这些炎症因子导致眼内炎症反应和免疫损伤，最终导致视网膜/RPE细胞的损伤[32]。此外，Kunchithapautham等[36]以ARPE-19细胞为模型，采用H2O2和正常人血清联合处理的方式发现亚溶解型C5bMAC通过Src和Ras-Erk信号通路促进促炎血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的释放。由此可见，补体各组分在诱发干性和湿性AMD的炎症反应中均扮演重要角色。
3.4 补体异常与脉络膜新生血管
湿性AMD以脉络膜新生血管为主要表现形式，补体在新生血管形成中也起到重要作用。最初的研究表明，drusen中的过敏毒素C3a和C5a可以促进CNV形成。也有研究发现，C3a会增加VEGF的表达并降低色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)的表达，说明抑制C3活化及C3a的形成可以作为临床治疗CNV的潜在疗法[37]。C5a将产生炎症因子IL-17的γδT细胞募集到视网膜，其所产生和释放的IL-17可能导致VEGF增加，从而促进CNV形成[38]。靶向抑制C5a在激光诱导的小鼠CNV模型中减少了血管渗漏和新生血管面积，进一步表明靶向C5a的治疗作用[39]。此外，MAC形成在激光诱导的CNV中有着直接作用[40]。MAC通过直接上调VEGF或通过趋化因子CCL2间接刺激VEGF产生来促进CNV形成[41]。在激光诱导CNV形成的小鼠模型中，MAC与CCL2和VEGF产生之间有重要的相互作用[41]。膜调节蛋白CD59是抑制MAC形成的关键CRP。在激光损伤后，CD59-/-小鼠损伤部位出现的CNV和补体沉积增多[42]。采用可溶性的CR2-CD59抑制MAC，可以有效减少CNV，进一步支持补体激活可能是减少CNV的有效手段[42]。因此，抑制C3、C5和MAC等均可以抑制CNV的形成。近期研究发现，抗VEGF疗效欠佳与CFHp.Tyr402His变体之间存在关联，因此，补体基因中的基因型也与抗VEGF治疗相关，抑制补体和抗VEGF的双重治疗可能更适用于一些新生血管性AMD患者[43]。
尽管多种补体激活途径都参与CNV的发展，但替代途径尤为重要。CNV的形成分为损伤/血管生成和修复/纤维化2个阶段[44]。Parsons等[44]研究表明采用替代途径抑制剂CR2-fH可以加速激光诱导的CNV小鼠模型的修复过程，与之相比过敏毒素受体的抑制剂对于CNV的修复并无作用。另一研究采用腺病毒包装递送补体抑制剂CR2-fH，结果也表明其可以在眼中有效抑制替代途径的补体活化，进而抑制补体依赖性的CNV进展[45]。
3.5 补体异常的全身性表现
除了RPE、神经视网膜和视网膜小胶质细胞合成补体蛋白以外，人体内主要的补体合成器官为肝脏。因此，不能排除全身补体异常活化导致AMD患者视网膜中补体成分沉积的可能性[46]。早期研究发现，AMD患者血浆中失活形式的C3a-desArg水平显著升高。此后，也有研究发现湿性AMD患者血浆内的C3a-desArg水平升高。同时，Lechner等[47]研究也发现在湿性AMD患者血浆中C3a、C4a和C5a的水平升高，高水平的全身性补体激活可能增加湿性AMD患者出现视网膜下纤维化的风险[47]。Lin等[48]比较了早期至中期非渗出性AMD或GA患者与无AMD对照受试者体内补体蛋白水平的研究，表明非渗出性AMD患者和GA患者全身补体激活增加，全身补体抑制降低。此外，也有研究报道AMD患者血浆中C3、CFB、CFD、CFH和MAC等的含量出现改变[46]。但是，对于AMD患者血浆中补体成分含量的改变是眼局部补体异常的原因还是结果目前依然存在争议。
对于AMD患者视网膜中异常活化补体成分来源的探讨也为靶向补体的AMD新疗法的开发提出了新问题：靶向补体的药物在全身性给药和眼内局部给药之间如何选择？Bora等[49]采用腹腔内注射和玻璃体腔注射可溶性的重组小鼠CD59a-IgG2a蛋白治疗脉络膜新生血管，结果显示腹腔内注射抑制新生血管的有效率略高于玻璃体腔注射，但二者比较差异无统计学意义；
且腹腔内注射药物剂量更高，加大了引起全身不良反应的可能性[49]。与之相似，Liu等[41]采用腹腔内注射和视网膜下腔注射抗C6抗体治疗激光诱导的小鼠CNV，发现与对照相比，腹腔内注射C6抗体的抑制率为77%，视网膜下腔注射的抑制率为73%，但2种给药方式差异无统计学意义。因此，已有的研究也无法从给药方式为AMD视网膜内异常沉积补体成分的来源提供确切依据。
本文从多角度讨论了补体异常在AMD中扮演的角色，补体相关因子及复合物在AMD进展中的作用见表1。大量基础和临床研究发现补体异常活化是AMD发病机制中的重要环节。针对AMD中特定补体成分的药物开发也逐渐增多，如针对C3的坎普他汀和针对C5的依库珠单抗等[50-51]，这些药物不仅应用于CNV治疗，在干性AMD中也有着针对性的治疗作用[28]。值得注意的是，在临床试验评估中这些补体相关药物的临床治疗效果非常有限。其中，兰帕利珠单抗，一种抗CFD的抗体类药物，在2期临床试验治疗萎缩性AMD中取得了良好的疗效，但是在最近Genentech公布的一项3期临床试验结果中未能观察到治疗效果[52]，这可能是由于药代动力学和药物输送的影响以及罕见变体的作用[53]。此外，Tran等[54]采用基因编辑CRISPR-Cas9系统对AMD进展敏感的补体风险因子CFH变体进行碱基编辑，在细胞水平证实了基因编辑尽管目前效率较低，但可以实现定点碱基替换，且未检测到脱靶效应，提示基因编辑系统运用于AMD基因治疗具有潜在的可行性。因此，进一步研究AMD中补体异常活化的致病作用机制，进而开发补体相关的AMD治疗药物，是获得更加安全、有效的AMD临床治疗方法的途径之一。
表1 补体相关因子及复合物在AMD进展中的作用补体因子与复合物作用C3参与补体活化级联反应:参与丝氨酸蛋白酶的级联酶解反应形成MAC,进而损伤细胞及周围细胞形成drusen:是drusen的重要成分,参与其形成[29]C3a诱发炎症反应:C3a可以通过刺激ATP释放和激活NL-RP3炎性小体来促进人单核细胞中的炎症因子IL-1β的分泌[33],进而导致眼内炎症和免疫损伤促进CNV:C3a增加VEGF的表达并降低PEDF的表达[37]C5参与补体活化级联反应:参与丝氨酸蛋白酶的级联酶解反应形成MAC,进而损伤细胞及周围细胞形成drusen:是drusen的重要成分,参与其形成[29]C5a诱发炎症反应:C5a作为启动信号激活RPE细胞炎性小体并促进IL-1β分泌[34];C5a启动RPE细胞中的炎性小体,使细胞死亡方式从凋亡转变为焦亡,增加光氧化介导细胞死亡的易感性[35],释放炎症因子导致眼内炎症和免疫损伤促进CNV:C5a将产生炎症因子IL-17的γδT细胞募集到视网膜,释放的IL-17导致VEGF增加,从而促进CNV形成[38]MAC损伤细胞:直接裂解细胞并对周围细胞造成损伤形成drusen:drusen的重要成分,参与其形成[29]促进CNV:Sublytic MAC促进VEGF从RPE的释放[36];在激光诱导的小鼠CNV模型中促进VEGF的释放和CNV形成[40];MAC通过直接上调VEGF或通过趋化因子CCL2间接刺激VEGF产生来促进CNV形成[41]CFB参与补体活化级联反应:参与补体替代途径的活化,形成MAC,进而损伤细胞及周围细胞形成drusen:是drusen的重要成分,参与其形成[29]CFH突变引起补体激活:Y402H多态性与RPE/脉络膜中的MAC显著增加相关[16]形成drusen:是drusen的重要成分,参与其形成[29];CFH的遗传变异与AMD进展密切相关,CFH遗传多态性影响其与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的结合,导致Bruch膜中脂蛋白及drusen累积[15] 注:AMD:年龄相关性黄斑变性;drusen:玻璃膜疣;MAC:攻膜复合物;IL:白细胞介素;VEGF:血管内皮生长因子;PEDF:色素上皮衍生因子;CNV:脉络膜新生血管;RPE:视网膜色素上皮
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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