【www.zhangdahai.com--其他范文】
唐意涵，马丁凌，梁毛迪，袁成钢，李梦环，侯艳婷，孙超月，张君
(石河子大学医学院/新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832000)
肥胖已成为一个全球性的公共健康问题，并且与心血管疾病和2型糖尿病等疾病密切相关[1]。肥胖主要是由于机体能量的摄入量长期大于消耗量，多余的能量以甘油三酯的形式储存在脂肪组织中而导致[2]。传统观点认为哺乳动物有两种脂肪组织：白色脂肪组织(White adipse tissue, WAT)和棕色脂肪组织(Brown adipose tissue, BAT)。其中白色脂肪组织最为常见，并发现作为皮下组织，分布在腹部、大腿和腰部，而棕色脂肪组织主要分布在血管周围、心外膜、肾上腺和肩胛区[3]。棕色脂肪组织和白色脂肪组织在形态和功能上完全不同。白色脂肪组织是储存过剩能量的主要组织，有较少的线粒体和大脂滴，能将体内过多的能量以甘油三酯的形式储存起来，当能量缺乏时，水解为游离脂肪酸释放入血循环，以供产能。棕色脂肪组织是一种耗能组织，有更多的线粒体和小脂滴，其线粒体富含解偶联蛋白1(Uncoupling protein 1, UCP1)，可以跨过线粒体内膜运输质子，破坏氧化磷酸化，而机体对ATP的需求迫使更多脂肪分解，实现非颤抖性产热[4-6]。近期研究发现，在寒冷、运动刺激或β3肾上腺素受体激动剂作用下，可以促进UCP1和过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)等产热基因的表达，并且白色脂肪组织中UCP1阳性脂肪细胞数量会明显增加，并发挥类似于棕色脂肪的产热作用，其被称为“米色脂肪细胞”(Beige adipocyte)[7]。米色脂肪细胞可以增加能量代谢，产生减肥效应，并由于米色脂肪细胞来源于白色脂肪细胞的转化，因此将这一过程称为白色脂肪棕色化[8-11]。而热中性环境可以使棕色脂肪失活，向白色脂肪转变[12]。
Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一类含锌指的转录因子，可调节细胞增殖、分化、发育和程序性死亡。其功能的改变与许多人类疾病的病理生物学有关，包括心血管疾病、代谢紊乱和癌症[13]。KLF7对包括瘦素在内的多种脂肪细胞因子的表达有抑制作用，并且是哺乳动物脂肪细胞分化的负调控因子，基因多态性和关联分析显示，KLF7还是糖尿病和肥胖症的相关基因[14-16]。而KLF7是否在白色脂肪棕色化过程发挥作用尚未见文献报道。
为此，本实验以C57BL/6小鼠为研究对象，通过高脂饮食诱导建立肥胖小鼠模型，观察白色脂肪棕色化过程中棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中KLF7蛋白表达情况，为深入揭示KLF7的调控功能和生物学功能奠定基础。
1.1 实验动物与分组
选择4周龄C57BL/6雄性小鼠36只，购自赛业(广州)生物科技有限公司，饲养于石河子大学医学院实验动物中心。适应性喂养一周后，将小鼠按体重随机分为普通饮食组(normal diet, ND)(n=6)和高脂饮食组(high-fat diet, HFD)(n=30)。分组喂养8周成功构建饮食诱导的肥胖模型后，将高质饮食组小鼠随机分为室温组(n=6)、4 ℃冷刺激处理组(n=6)、32 ℃热中性处理组(n=6)、生理盐水处理组(Saline)(n=6)和β3肾上腺素能受体激动剂处理组(CL316,243)(n=6)。本研究经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会审批(编号：A2019-086-01)。
1.2 小鼠肥胖模型的建立
2组C57BL/6小鼠均分笼喂养，普通饮食组饲以基础饲料(江苏美迪森生物医药有限公司提供)，高脂饮食组饲以高脂饲料(60%脂肪)。每天更换饮用水，隔日清理粪便，每天监测小鼠饮食量、每周测量小鼠体长和体重1次。
1.3 实验仪器
电子分析天平(中国赛多利斯公司)、动物恒温培养箱、Western blot电泳仪(Bio-Rad公司)、高速冷冻离心机(Thermo公司)、超低温冰箱(Thermo公司)、血糖仪(瑞士罗氏公司)。
1.4 实验试剂
CL316,243、UCP1抗体、PGC-1α抗体和KLF7抗体购于Abcam公司，β-Tubulin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司, 生理盐水(saline)购于新疆华世丹药业股份有限公司。
1.5 方法
1.5.1 给药方法及剂量
室温组小鼠置于25 ℃环境7 d，4 ℃冷刺激处理组小鼠置于4 ℃环境7 d，32 ℃热中性处理组小鼠置于32 ℃动物饲养恒温箱7 d，β3肾上腺素能受体激动剂处理组每日按照1 mg·kg-1腹腔注射β3肾上腺上腺素能受体激动剂CL316,243 处理7 d, 生理盐水处理组小鼠每日腹腔注射等量生理盐水。
1.5.2 摄入量的测定
当日称量加入小鼠饲料重量，次日同时称量剩余饲料重量，通过计算，得出小鼠每日的食物摄入量。
1.5.3 样本收集
处理7 d结束后，解剖分离小鼠棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织并称重，将脂肪组织迅速放入-80 ℃冰箱冻存，用于后续测定KLF7蛋白表达水平。
1.6 数据处理
应用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，所有计量数据首先需进行正态性检验，符合正态分布的数据选择独立样本t检验(均数±标准差)，不符合正态分布的数据选择非参数秩和检验(数据以中位数呈现，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.1 小鼠体重比较
如图1所示，分组喂养8周后，高脂饮食组小鼠体重显著高于普通饮食组，差异有统计学意义(P<0.001)。
图1 普通饮食组(ND)与高脂饮食组(HFD)小鼠体重(A)和大体形态(B)比较
2.2 棕色化和白色化条件对小鼠体重、摄食量和血糖的影响
如图2所示，不同处理组小鼠各自处理7 d后，通过对小鼠体重称量发现，与对照组相比，β3肾上腺素能受体激动剂处理组和32 ℃热中性处理组没有差异显著性，而4 ℃冷刺激组小鼠体重显著降低，并且血糖显著升高。与对照组相比，β3肾上腺素能受体激动剂处理组和4 ℃冷刺激组小鼠摄食量没有差异显著性，而32 ℃热中性处理组小鼠摄食量显著减少。
图2 棕色化和白色化条件对小鼠体重体重(A)、血糖(B)和摄食量(C)的影响
2.3 棕色化和白色化条件对小鼠脂肪组织重量和形态的影响
如图3所示，通过完整的分离棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织，并进行称量计算后发现，与对照组相比，β3肾上腺素能受体激动剂处理组和32 ℃热中性处理组小鼠附睾白色脂肪组织重量显著降低，4 ℃冷刺激处理组小鼠棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织重量均显著降低。
随后与对照组相比，β3肾上腺素能受体激动剂和4 ℃冷刺激处理可使小鼠棕色脂肪组织颜色更深。
图3 棕色化和白色化条件对小鼠3种脂肪组织重量(A)和形态(B)的影响
2.4 3种脂肪组织中KLF7蛋白表达水平差异
如图4所示，完整分离对照组小鼠的棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织进行Western blot检测，发现PGC-1α、UCP1和KLF7的蛋白含量在棕色组织组织中含量最高。
2.5 高脂饮食与普通饮食小鼠脂肪组织中KLF7表达差异
如图5所示，高脂饮食喂养八周后，完整分离高脂饮食和普通饮食组小鼠的棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织进行Western blot检测，发现普通饮食组小鼠的棕色脂肪组织和腹股沟白色脂肪组织中PGC-1α和UCP1含量升高，而高脂饮食组小鼠的棕色脂肪组织和腹股沟白色脂肪组织中KLF7含量升高。
图4 小鼠棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中KLF7蛋白表达水平
图5 高脂饮食与普通饮食小鼠棕色脂肪组织(A)、腹股沟白色脂肪组织(B)和附睾白色脂肪组织(C)中KLF7蛋白表达差异
2.6 β3肾上腺素能受体激动剂处理对小鼠脂肪组织中KLF7表达的影响
如图6所示，完整分离对照组和CL316，243处理小鼠的棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织进行Western blot检测，发现UCP1和KLF7会因β3肾上腺素能受体激动剂处理而升高。
图6 β3肾上腺素能受体激动剂对高脂饮食小鼠棕色脂肪组织(A)、腹股沟白色脂肪组织(B)和附睾白色脂肪组织(C)中KLF7表达的影响
2.7 4 ℃冷刺激和32 ℃热中性处理对小鼠脂肪组织中KLF7表达的影响
如图7所示，完整的分离室温处理组、4 ℃冷刺激处理组和32 ℃热中性处理组小鼠的棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织进行Western blot检测，发现与室温组小鼠相比，UCP1、PGC-1α和KLF7会因4 ℃冷刺激而升高，而32 ℃热中性条件下会使UCP1、PGC-1α和KLF7降低。
图7 4 ℃冷刺激和32 ℃热中性条件下对高脂饮食小鼠棕色脂肪组织(A)、腹股沟白色脂肪组织(B)和附睾白色脂肪组织(C)中KLF7表达的影响
肥胖源于能量摄入和能量消耗之间的长期不平衡，并且与心血管疾病、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病密切相关[17]。白色脂肪组织可储存多余的能量，棕色和米色脂肪组织可以产热，并以热量的形式消耗能量。已有研究表明，成年人中存在活跃的棕色脂肪组织，并且其与较低的体重指数(BMI)、较低的年龄、较低的室外温度、女性性别和较低的血糖水平有关[18]。因此，促进白色脂肪棕色化对于治疗肥胖及相关代谢性疾病具有广阔的应用前景。
转录因子KLF7 具有核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)，能够与入核载体结合，通过核孔复合体运送至细胞核。KLF7 蛋白羧基端具有保守的 3 个 C2H2 型锌指结构域[19]，可以结合靶 DNA 的 CACCC 基序或富含 GC 的序列，调控靶基因表达[20]。KLF7在脂肪、胰腺、肝脏和骨骼等组织均表达。已有研究表明，KLF7在胰岛β细胞中抑制胰岛素的表达和释放；
在脂肪细胞中能够抑制脂联素和瘦素的合成，促进炎症因子IL-6的释放[16]。并且KLF7还是是哺乳动物脂肪细胞分化的负调控因子，KLF7的表达在3T3-L1脂肪细胞分化时降低，并且KLF7过表达会抑制脂肪生成。类似地，KLF7在人前脂肪细胞中的过表达会抑制了其向脂肪细胞的分化，并降低了脂肪生成相关基因的表达[13]。本研究的结果显示，棕色化条件下如β3肾上腺素能受体激动剂处理和4 ℃冷刺激处理可在不改变小鼠饮食量情况下，其棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织的重量均呈降低趋势，并且促进KLF7的表达增加，与UCP1呈同步变化，提示KLF7可能在白色脂肪棕色化过程发挥抑制脂肪细胞分化和脂肪合成的作用，同时KLF7作为一个转录因子是否能转录激活UCP1有待进一步研究。
