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陈丹丹，宋 亮，卫培峰
（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）
急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）作为临床上一种常见的消化系统急重症，主要表现为剧烈持续的上腹部疼痛、恶心呕吐、发热、血胰酶升高等［1］，AP 的发病率逐年升高，目前已达到万分之三十，其中10%～20%会发展为重症急性胰腺炎［2-3］，发现急性胰腺炎就要及时有效的治疗，如果病情继续发展，就会危及患者的生命健康，死亡率为20%～40%。近年来，随着对AP 的研究发现，采用中药治疗AP 会减少副作用及并发症的发生，降低死亡率［4-6］。
中医治疗AP 主要是以疏肝理气、清热解毒、通里泻下为主，柴胡-黄芩是根据中医“益活清下”治疗思想为指导加疏肝解郁、活血散瘀、理气止痛而生［7-9］，能够修复胰腺损伤，清除肠道生物屏障和肠源性内毒素，抑制蛋白酶激活和肠道细菌移位，具有一定的抗炎、止痛和抗氧化活性［10-12］。本研究通过腹腔注射20%L-精氨酸复制急性胰腺炎大鼠模型，观察柴胡-黄芩对急性胰腺炎大鼠炎性反应、疼痛反应及抗氧化能力的影响，为该药对用于治疗急性胰腺炎提供理论依据。
1.1 试剂与仪器
白细胞介素-1β（Interleukin-1β，1L-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6，1L-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor nercrosis factor-α，TNF-α）、酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；
过氧化氢酶（Catalase form micrococcus lysodeikticus，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒采购自南京建成生物工程研究所有限公司；
抗p-NF-κB p65 抗体、抗NF-κB p65 抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。
使用仪器包括：Practum-5101-1CN-电子天平（德国赛多利斯公司）；
TGL-20B-离心机（上海雅程仪器设备有限公司）；
1510-03241-酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；
BS-330E-迈瑞全自动血清生化仪（深圳迈瑞生物医疗电子有限公司）等。
1.2 试验动物
SPF 级雄性SD 大鼠30 只，约6 周龄，体质量200 ± 20 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（川）2020-030。动物饲养于陕西中医药大学陕西中药资源产业化省部共建重点实验室SPF级动物实验室。
1.3 试药
称取柴胡饮片15 g，黄芩饮片15 g（根据柴芩承气汤中柴胡-黄芩剂量）［12］，加入8倍量水，将两味药浸泡30 min。煮沸10 min 后保持微沸30 min，过滤后保留滤液；
药渣加入6 倍量水，煮沸后保持微沸20 min，过滤；
合并2次滤液，配成生药用量为1 g/mL的柴胡-黄芩水煎液。
2.1 动物分组及给药
SD 雄性大鼠，适应性喂养7 d 后，随机分为3组：阴性对照组、AP 模型组和柴胡-黄芩干预组，每组10 只。其中，AP 模型组和柴胡-黄芩干预组腹腔注射20% L-精氨酸（L-Arg，2.5 g/kg，2 次，间隔1 h）复制AP 模型［13］，随后分别给予生理盐水（6 mL/kg）和柴胡-黄芩水煎液（6 mL/kg；
约为临床人用剂量12.0 倍，人体质量按60 kg 计）灌胃，每天2 次，连续3 d。阴性对照组给予相应的生理盐水腹腔注射和灌胃。
2.2 大鼠疼痛行为观察
将大鼠放入热板刺激仪的有机玻璃罩内适应30 min后取出，将热板升温至50℃，再次将大鼠放入有机玻璃罩内，从大鼠脚掌接触热板开始计时，大鼠第1 次出现舔后足或抬起即缩足反应时计时停止，此时间为大鼠脚掌回缩潜伏期（Paw withdraw latency，PWL）。
2.3 采集血清
首次注射L-Arg 或生理盐水72 h 后，用1%戊巴比妥钠［14］（6 mL/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血，收集至10 mL 离心管内，待血液凝固后，3 000 rpm/min离心20 min 后分离血清，分装冻存，标记后于-80℃冰箱保存。检测IL-6、IL-1β、TNF-α、CAT、GSHPx、MDA 活性；
采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清淀粉酶水平。
2.4 胰腺组织病理学检测
取胰腺组织后用4%多聚甲醛固定24 h 后，常规脱水、浸蜡、包埋、切片，脱蜡后进行染色，脱水后封片。显微镜下观测各组胰腺组织病理变化。
2.5 Western blot 法检测
取胰腺组织，加入蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA 试剂盒定量分析，随后常规进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗（p-NF-κB p65，1：1 000 稀释；
NF-κB p65，1：1 000 稀释；
GAPDH，1：2 000稀释）、洗膜、孵育二抗、洗膜、最后采用ECL发光，对图像进行数据采集和分析。
2.6 统计学方法
采用SPSS 17.0 统计软件处理数据，计量以均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
3.1 大鼠疼痛行为
与阴性对照组比较，AP 模型组大鼠第1 次出现疼痛行为（舔后足或抬起）的时间显著缩短，与AP模型组比较，柴胡-黄芩药对干预能使大鼠疼痛行为第1次出现时间延长，见表1。
表1 大鼠第1次疼痛行为的出现时间Tab.1 The appearance time of the first pain behavior in rat
3.2 胰腺组织病理改变
阴性对照组大鼠的胰腺细胞结构完整清晰，未见炎性细胞。AP 模型组大鼠胰腺组织可见大片凝固性坏死，未坏死细胞也表现出结构模糊不清，且组织明显水肿，细胞间质内可见大量炎性细胞浸润。柴胡-黄芩干预后，胰腺组织水肿程度减轻，片状坏死区域减少，浸润的炎性细胞数量降低，但仍可见少量坏死区域。见图1。
图1 大鼠胰腺组织H&E染色Fig.1 H&E staining of pancreatic tissue in rats
3.3 血清淀粉酶水平
与阴性对照组相比，AP模型组血清淀粉酶水平明显升高，与AP 模型组比较，柴胡-黄芩干预能够降低血清淀粉酶水平。结果见表2。
表2 血清淀粉酶活性Tab.2 The amylase activity in serum
3.4 血清炎性因子水平
和阴性对照组相比，AP模型组大鼠血清的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平明显升高，与预期结果一致，而使用柴胡-黄芩干预之后，三种炎性因子表达水平均出现回落。结果见表3。
表3 血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量Tab.3 The contents of IL-6、IL-1β and TNF-α in serum
3.5 大鼠胰腺组织NF-κB通路活性变化
如图2所示，与阴性对照组相比，AP 模型组大鼠胰腺组织内NF-κB p65蛋白的磷酸化程度明显升高，表现为p-NF-κB p65 蛋白表达量显著增加，而NF-κB p65 蛋白表达量无明显改变。柴胡-黄芩干预后，p-NF-κB p65蛋白表达下降，未明显影响NFκB p65 蛋白表达。提示柴胡-黄芩干预抑制了AP发生时出现的NF-κB通路活化。
图2 胰腺组织NF-κB通路活性变化Fig.2 The activity of NF-κB pathway in pancreatic tissue
3.6 血清CAT、GSH-Px、MDA含量
与阴性对照组相比，AP 模型组大鼠血清的CAT、GSH-Px 水平明显降低，MDA 水平显著性升高。使用柴胡-黄芩干预之后，大鼠血清CAT、GSHPx 水平出现回升，MDA 水平显著回落。结果见表4。
表4 血清CAT、GSH-Px和MDA水平Tab.4 The levels of CAT、GSH-Px and MDA in serum
AP 发病急，病情进展快，在临床上出现胰腺弥漫性出血、组织局部坏死等，并伴有脓毒血症、多脏器衰竭等，如果不能及时采取有效治疗措施，疾病致死率较高［13-14］。目前认为，AP 诱发多器官损伤的主要发病机制在于：①局部炎症引起大量炎性细胞的浸润和活化，释放众多细胞因子和炎性介质，导致炎性反应发生；
②肠黏膜屏障功能障碍，使得肠功能衰竭，出现细菌移位［15］。已有研究证明，抑制AP 时炎症因子释放和提高抗氧化能力能够改善AP的病理进程［16-17］。
中药药对配伍是在辨证审机、确立治法的基础上，按照组方结构选择药物，酌定用量而妥善配伍组成的有特定剂型用法的配伍药对。中药药对柴胡-黄芩可以有效缓解急性胰腺炎。柴胡能够疏散退热并有抗炎作用，黄芩能够清热燥湿、泻火解毒、对急、慢性炎症均有抑制作用，有实验证实，二者配成药对，可以抑制炎症反应，而且1：1的配对比例效果最佳［18］，起到缓解急性胰腺炎症状的作用。因此，本研究选择柴胡-黄芩药对AP进行干预，观察柴胡-黄芩联用对AP 大鼠的治疗效果。研究结果发现，柴胡-黄芩能够延长大鼠疼痛行为第1次出现时间，说明此药对具有减轻炎性疼痛的作用，但潜在机制尚有待阐明。而且，柴胡-黄芩干预能够改善AP 大鼠的胰腺损伤，明显降低AP 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平，并抑制大鼠胰腺内NFκB通路活化，说明柴胡-黄芩对胰腺的保护作用可能和抑制NFκB通路，减少促炎因子表达有关。机体具有清除多余自由基的能力，主要依靠内源性自由基清除系统，包括超氧化物歧化酶、CAT、GSH-Px 等酶类发挥作用［19］。AP 发生时，机体的抗氧化能力降低，经柴胡-黄芩干预治疗后使CAT、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，提示柴胡-黄芩能够提高抗氧化能力。本研究结果说明柴胡-黄芩可能通过抑制炎性反应和提高抗氧化能力发挥对AP 的治疗作用，但1：1 的配比是否是最佳比例，需要后续的实验证实。
中药药对既是辨证论证的产物，也是古今医家临床经验与学术思想的载体。中药药对作为理法方药的重要组成部分，一直是中医防治疾病的主要工具。研究药对配伍是对传统中医药配伍理论的一种传承创新与丰富发展，对开拓中药新药创制研究与推进中医药现代化、国际化发展具有重要意义。
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