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陈昆圆， 文艺， 许相奎， 周博， 张红瑞， 王铁霖， 孟颢光， 蒋士君， 崔江宽
(1.河南农业大学植物保护学院/省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室，河南 郑州 450002；
2.河南省农业科学院植物保护研究所，河南 郑州 450002；
3.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700)
丹参(Salviamiltiorrhiza)是多年生草本药用植物，以干燥根和根茎入药，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦等功效，广泛应用于心血管疾病的治疗，是我国常用大宗中药材之一[1-2]。丹参在中国大部分地区均有分布，主产于山东、河南、山西、陕西、四川等地[3-4]。目前，河南省丹参种植面积约1.67万hm2。随着丹参的大面积单一种植，丹参病虫害问题逐年加重，丹参根结线虫病的发生尤为明显。根结线虫病一般引起丹参减产10%～20%，严重时达30%以上，对丹参的产量和品质影响巨大，已成为限制丹参产业发展的主要因素之一[5]。陈小红等[6]通过田间调查，明确了四川省丹参根结线虫病的病原为南方根结线虫(Meloidogyneincognita)。高志华报道了山东地区引起丹参根结线虫病的病原为南方根结线虫、花生根结线虫(M.arenaria)和爪哇根结线虫(M.javanica)[7]。TSAI等[8]首次报道了台湾花莲县丹参根结线虫病的病原为南方根结线虫。目前，尚未见到河南省丹参根结线虫病害研究的相关报道。
作者在前期河南省丹参线虫病害调查中发现，部分丹参种植基地大面积发生根结线虫病，严重发病丹参地上部植株明显矮小，叶片黄化，萎蔫焦枯，甚至全株凋亡；
地下根和块茎畸形、扭曲，有明显可见的瘤状根结，撕开表皮肉眼可见米粒状白雌虫。本研究采用形态学与分子生物学鉴定相结合的方法对河南地区丹参根结线虫病病原进行鉴定，以期明确丹参根结线虫的发病种类，为丹参根结线虫的快速诊断和科学防控奠定基础。
1.1 病样采集及症状观察
2019—2021年，在河南省许昌市、三门峡市、南阳市等重要丹参种植园区采集到根结线虫危害的丹参样品。选择典型根结症状的丹参和病株根际土进行取样，取样深度为10～20 cm，然后将样品混匀放入自封袋中并标记。本研究在许昌地区采集病害样品7份，三门峡地区采集病害样品7份，南阳地区采集病害样品8份，共计22份样品。
1.2 线虫种群纯化与保存
在体视显微镜(SZ-650，重庆奥特光学仪器有限责任公司)下直接挑选丹参病根组织中的单一卵块，接种到预先培植在灭菌砂质土壤中长有2～3片真叶的番茄苗根部，后置于28/20 ℃温室中(白天：黑夜=16 h∶8 h)进行线虫种群的纯化与扩繁。
1.3 形态学鉴定
卵块孵化的二龄幼虫(J2)和雌虫用于形态鉴定。观察J2及雌虫头部和口针等特征，测量其体长、体宽、口针长和背食道腺开口至口针基部球的距离(DGO)等形态指标，J2和雌虫分别测量20个样本。使用配有NIS-Elements AR的尼康光学显微镜(Nikon Eclipse Ti-S)对制作的线虫玻片进行形态观察、数据测量和拍照。
雌成虫会阴花纹的制作与观察：参照张绍升[9]的方法(略有改动)，在体视显微镜下从丹参病根组织挑取成熟雌虫，移到滴有1滴45%乳酸的载玻片上，用手术刀切下虫体尾端(虫体后部约1/4处)，使用竹针尖端的纤丝仔细剔除附在内侧的卵及其他粘连物并稍加修饰，仅留下会阴花纹部分。将会阴花纹转移至滴有1滴纯甘油的载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察拍照。
1.4 分子生物学鉴定
1.4.1 线虫DNA提取 参照彭德良等[10]线虫DNA提取方法(略有改动)。随机从不同丹参病根组织内挑取白雌虫于PCR单管中，加入20 μL ddH2O，液氮反复冻融后用玻璃棒研磨3次，加入14 μL 10×PCR-buffer缓冲液(不含Mg2+)(宝日医生物技术(北京)有限公司)、6 μL蛋白酶K(600 mg·L-1)(德国Merck KGaA公司)。用迷你离心机(台湾Cubee)进行瞬时离心(4 800 r·min-1)30 s，后置于PCR仪(EppendorfMastercycler nexus PCR 仪，德国Eppendorf公司)中65 ℃温育90 min，95 ℃灭活10 min。最后，用迷你离心机(台湾Cubee)离心(4 800 r·min-1)1 min，取上清液转移至新的离心管，-20 ℃保存备用。
1.4.2 rDNA-ITS序列分析 以上述提取的DNA为模板，使用根结线虫通用引物M18S(5′-AACCTGCTGCTGGATCATTAC-3′)和M28S(5′-GTATGCTTAAGTTCAGCG-3′)进行rDNA-ITS序列扩增[11]。采用50 μL扩增体系：2×EsTaq Master Mix(Dye)(北京康为世纪生物科技有限公司)25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O补至50 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；
94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；
72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳(DYY-6C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司)，120 V，30 min，之后用凝胶成像仪(InGenius凝胶成像系统，英国Syngene公司)进行观察拍照。PCR产物用胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收产物与pClone007 Versatile Simple Vector Kit载体(北京擎科生物科技有限公司)连接，连接产物转化至TreliefTM5α感受态细胞(北京擎科生物科技有限公司)中，挑取阳性克隆菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行单向测序。将获得的rDNA-ITS序列在NCBI上进行Blast比对分析，用MEGA 7.0软件的邻接法(Neighbor-Joining)进行系统发育树分析。
1.4.3 特异性引物检测 根据rDNA-ITS序列分析结果，选用南方根结线虫特异性引物Inc-K14-F(5′-GGGATGTGTAAATGCTCCTG-3′)和Inc-K14-R(5′-CCCGCTACACCCTCAACTTC-3′)[12]对供试的丹参根结线虫22个DNA样本进行PCR特异性扩增。采用25 μL扩增体系：
2×Es Taq Master Mix(Dye)12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O补至25 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；
94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；
72℃终延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，120 V，30 min，之后用凝胶成像仪进行观察拍照。
1.5 致病性测定
将生长14 d的健康丹参植株幼苗移栽于灭菌砂质土壤(m(沙)∶m(土)=1∶1)的塑料盆，待3～5 d植株成活后于根部接种1 mL纯化培养的J2悬浮液(400条·mL-1)，以不接种线虫为对照，置于28/20℃温室(白天∶黑夜=16 h∶8 h)中培养。在接种后7、15 d使用次氯酸钠酸性品红染色法调查线虫侵染发育情况，42 d后观察植株发病症状。
2.1 病害症状
对采集的丹参样品进行症状观察，丹参根系被根结线虫侵染后，植株地上部表现出明显矮化，叶片失绿黄化，发育不良，严重者整株枯萎(图1a)。丹参感染根结线虫后主根根尖处开始膨大，随后侧根也出现膨大现象，形成不规则白色根结，随着根结逐渐膨大，根结的颜色由浅变深，直至根部腐烂坏死(图1b～c)。解剖受害根结可见白色球形或梨形的雌虫及埋生于根结内的褐色卵囊，表明丹参已感染根结线虫。
2.2 形态学鉴定结果
丹参根结线虫的J2呈线形蠕虫状，头部无突出与缢缩，有不完整环纹，口针纤细，基部球小，尾呈长锥形，末端有一清晰的透明区(图2a～c)。J2体长为404.14(357.22～458.12)μm，体宽为14.12(12.41～16.07)μm，口针长为10.31(9.17～11.34)μm，DGO长为2.37(2.19～2.67)μm，尾长为49.46(44.92～54.31)μm；
雌虫虫体乳白色，球形或梨形，有一明显突出的短颈，口针纤细，口针锥部略向背部弯曲(图2d)。体长为607.99(487.67～708.41)μm，体宽为377.09(324.48～435.12)μm，口针长为16.86(14.12～20.41)μm，DGO长为3.34(2.82～3.79)μm。
a：田间症状；
b～c：根部被害症状 a: Field symptoms; b-c: Root symptoms图1 丹参根结线虫田间发病症状Fig.1 Symptoms of root-knot nematode on S.miltiorrhiza in field
a：2龄幼虫整体外观；
b：2龄幼虫头部；
c：2龄幼虫尾部；
d：雌成虫；
e：会阴花纹(a～c：标尺 20 μm；
d：标尺100 μm；
e：标尺20 μm)
雌虫会阴花纹呈圆形或椭圆形，背弓高而方，由平滑到波浪形的线纹组成。有些线纹在侧面分叉，无明显侧线，线纹弯向阴门，尾端区无刻点(图2e)。丹参根结线虫的形态鉴定特征与已报道的多个南方根结线虫形态特征一致。因此，可以初步判定危害河南省丹参的根结线虫种类为南方根结线虫。
2.3 分子生物学鉴定结果
利用根结线虫通用引物M18S/M28S对河南省丹参根结线虫22个DNA样本进行rDNA-ITS扩增。结果显示，22个样本均可以获得500 bp左右目的条带(图3)。扩增产物经测序得到544 bp的序列，与预期序列吻合。将丹参根结线虫的rDNA-ITS序列比对整理提交至GenBank，获得登录号：OM690624.1。在NCBI上Blast比对分析显示，河南丹参根结线虫与GenBank中南方根结线虫MT071557.1、MT071558.1和MT071559.1序列同源性达100%。以丹参根结线虫22个DNA为模板，利用南方根结线虫特异性引物Inc-K14-F/Inc-K14-R进行PCR扩增，可以得到明显单一的399 bp特异性目的片段(图4)。
M：DNA Marker DL2000；
1～22：丹参根结线虫种群 M: DNA Marker DL2000; 1-22: Populations of root-knot nematode on S.miltiorrhiza图3 丹参根结线虫rDNA-ITS序列PCR检测结果Fig.3 PCR detection results of rDNA-ITS of root-knot nematode on S.miltiorrhiza
M：DNA Marker DL2000；
1～22：丹参根结线虫种群；
23：不含DNA的阴性对照；
24：阳性对照 M: DNA Marker DL2000; 1-22: Populations of root-knot nematode on S.miltiorrhiza; 23: Negative control without DNA; 24: Positive control图4 丹参南方根结线虫特异性引物PCR电泳检测结果Fig.4 Results of species special primers PCR detection of M.incognita on S.miltiorrhiza
2.4 致病性测定结果
健康丹参幼苗接种南方根结线虫二龄幼虫7 d后，可观察到大量幼虫侵染丹参根尖(图5 a)，并开始膨大；
随后侧根根部也出现膨大现象，根内J2逐步发育转变为3龄幼虫(图5 b)；
15 d时染色，在根内可以观察到3龄和4龄幼虫(图5 c～d)；
42 d时根结症状明显，形成了不规则白色米粒状根结，并随着根结逐渐膨大，颜色由白色变为黄褐色，解剖受害根组织可见白色球形或梨形的雌虫及埋生于根结内的褐色卵囊(图5 e～f)。接种植株地上部分明显矮化，侧枝枯萎，叶片失绿黄化，这些症状与田间病株的病症一致(图5 g)，对照组无发病。从病根上分离出的根结线虫经再次鉴定，确认为南方根结线虫，表明南方根结线虫为河南省丹参根结线虫病的病原线虫。
2.5 系统发育分析
从GenBank数据库选择南方根结线虫及其近缘种的rDNA-ITS序列，以松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)作为种外群对照，与供试线虫构建系统发育树(图6)。结果表明，丹参根结线虫种群与GenBank中8个分别来源于中国河南、江苏、福建、台湾等地，以及巴西，印度，美国等国的南方根结线虫种群(登录号分别为MT071559.1、MT490926.1、MT159699.1、MF168964.1、KT869139.1、MW627496.1、MT921010.1、MK292132.1)的序列以100%的支持率聚集在同一支。此外，丹参根结线虫种群与象耳豆根结线虫(M.enterolobii)、西班牙根结线虫(M.hispanica)、北方根结线虫(M.hapla)、拟禾本科根结线虫(M.graminicola)、较小根结线虫(M.minor)、伪根结线虫(M.fallax)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、苹果根结线虫(M.mali)等近缘种聚类在不同分支上，南方根结线虫与象耳豆根结线虫亲缘关系较近，并能与近缘种显著区分。
a～b：接种后7 d；
c～d：接种后15 d；
e：接种后42 d根部症状；
f：接种后42 d发病根部雌虫和卵块；
g：左边为接种后42 d，右边为空白对照(图a～d，f放大倍数为6倍)
根结线虫(Meloidogynespp.)是一类重要的植物寄生线虫，危害遍及粮食作物以及蔬菜等作物，其寄主分属114个科3 000多种植物，特别是侵染茄科、葫芦科、十字花科等植物最为严重[13]。根结线虫一般可使作物减产10%～20%，严重时可达75%以上，严重制约了农作物的优质高产[14]。目前，已报道的根结线虫有90多种，对作物生产危害严重的根结线虫主要有4种：南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫[13,15]，其中南方根结线虫因发生面积大、寄主种类多，已成为多地根结线虫的优势种群[16]。近年来，随着我国作物单一高密度种植模式的大规模应用及农业机械跨区域作业，根结线虫危害区域正在逐渐扩大，发病程度也逐渐加重，根结线虫的有效防控迫在眉睫。由于不同种类根结线虫之间存在显著的致病性差异，因此准确鉴定根结线虫的种类是防治根结线虫病的前提[17]。
根结线虫种类的鉴定方法主要有形态学鉴定、同工酶表型分析、鉴别寄主试验和分子生物学鉴定[18]。线虫的形态学鉴定是应用范围最广泛的鉴定方法，但根结线虫种类的形态特征差异不明显且还经常发生变异，仅利用传统的形态学特征难以准确鉴定[19]。同工酶技术在根结线虫分类鉴定上是一种重要的技术手段，但同工酶的提取对线虫虫态的要求严格，需要大量线虫样品才能获得可靠结果，且蛋白质会受多种外界因素的干扰而影响鉴定结果[20-21]。鉴别寄主主要通过一套特定鉴别寄主来进行种水平的鉴定，但由于鉴别寄主法只能鉴定常见的四种根结线虫，且受寄主差异和环境的影响，鉴定结果往往差异较大[22]。线虫的DNA一般不会随着线虫虫态、寄主或环境的变化而出现改变。因此，基于线虫DNA的分子生物学鉴定技术得到广泛应用[18]。rDNA-ITS位于核糖体DNA的18S和28S的内转录间隔区，因其种内高度保守，种间差异明显，常用于种间分类鉴定[23]。苏圣淞等[24]通过形态学与rDNA-ITS序列分析对土沉香(Aquilariasinensis)根结线虫种类进行鉴定，首次报道了海南省澄迈地区土沉香上发生象耳豆根结线虫。SCAR(Sequence-characterized amplified region)特异性序列扩增是一种新型分子标记，具有结果稳定性好、可重复性强、灵敏度高的特点，结合rDNA-ITS序列分析，可以快速、准确、有效的区分植物寄生线虫属到种的水平[18]。周博等[25]利用形态学鉴定、SCAR-PCR检测与rDNA-ITS测序相结合的方法，首次报道了河南省焦作地区怀地黄(Rehmanniaglutinosa)病原根结线虫为南方根结线虫。因此，对常见的植物线虫，形态学鉴定结合分子生物学鉴定基本可以进行准确的物种分类，并且分子生物学鉴定具有重复性强，效率高的优势。
图6 基于根结线虫rDNA-ITS序列构建的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences of Meloidogyne spp.
河南地处中原，山川、盆地和平原相连，属暖温带和亚热带气候，复杂多样的地理环境和四季分明的气候不仅适宜多种农作物和道地药材生长，而且适宜根结线虫的发生危害。河南是我国道地丹参最适宜的种植地区之一[26]，丹参在河南道地药材种植中面积排名第四[27]。然而，河南省丹参根结线虫发生分布和危害损失研究一直或缺。本研究对河南省丹参根结线虫病害进行了系统普查，在河南省许昌市、三门峡市、南阳市等地发现丹参根结线虫的危害。采用田间症状分析、形态学鉴定、分子生物学鉴定和柯赫氏法则致病性验证，明确了为害河南省丹参的根结线虫为南方根结线虫。目前，中国丹参根结线虫病已在四川、山东、台湾等地发生危害，并有进一步蔓延的趋势。因此，一方面要加强丹参田间根结线虫发生动态监测，掌握其发生分布和危害损失；
另一方面，应尽快建立丹参无病育苗基地，针对丹参根结线虫发病地块制定相应的防控措施。采取轮作倒茬或在发病初期进行药剂防治，对于后期发病严重的地块可提前采收，降低损失；
也可在丹参采后至播种期间清除田间病残体并对土壤进行消毒处理[28]，降低虫口基数。
