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郭嘉 卞华 单雨 赵晶晶 张潇文 陈爽 卞博
(1河南中医药大学，河南 郑州 450000；
2南阳理工学院张仲景国医国药学院 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室)
类风湿关节炎(RA)主要累及关节，但仍应认为是一种包括关节外表现的综合征，如类风湿结节、肺部受累或血管炎及全身并发症〔1〕。RA有着严重的社会经济负担，除了主要的直接医疗费用外，还有功能残疾、工作能力减少和社会参与度下降的结果〔2〕。甲氨蝶呤通常是RA的一线药物，生物制剂如肿瘤坏死因子抑制剂，通常被认为是二线药物或可以添加双重治疗〔3〕。虽然现代医学已经取得了不错的进展，但由于药物疗效的不确切性及不良反应的可预见性，我们仍需不断完善和挖掘新的治疗策略以改善RA患者预后。
中医认为RA属“痹证”范畴，历代医家又称其为 “血痹”“鹤膝风”“白虎历节”等。汉代张仲景在《金匮要略》中指出：“血痹，阴阳俱微，寸口关上微，尺中小紧，外证身体不仁，如风痹状，黄芪桂枝五物汤(HQGZ)主之。”有关Meta分析显示〔4〕，HQGZ联合西药治疗类风湿关节炎比单用西药有更好的疗效，且不良反应显著降低。多项临床研究〔5～7〕显示，HQGZ在RA治疗中具有显著的减毒增效作用。刘佳维等〔8〕研究表明，HQGZ能明显减轻模型组大鼠关节炎症、滑膜增生、血管翳形成及软骨破坏,其机制可能与调控janus激酶信号转导和转录激活物(JAK-STAT)信号通路中白细胞介素(IL)-2、JAK3、STAT3、细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)1、SOCS3的表达相关。中西医结合治疗类风湿关节炎突破中西药各自用药治疗的局限性，可提高疗效，降低致残率，提高生活质量〔9〕，因此对于中医药防治RA的作用机制仍需进一步探究。目前HQGZ治疗RA的具体机制尚不清楚，本研究旨在探讨HQGZ对RA的作用机制。
1.1RA靶点获取 通过GEO数据库，以“Rheumatoid arthritis”为关键词进行搜索相关芯片，获取GSE93272、GSE93776的芯片数据原始文件和GPL570-55999的芯片基因注释文件。GSE93272芯片包含了275个样本，其中232个来自RA患者，43个来自健康人群；
GSE93776包含173个样本，其中83个来自RA患者，90个来自健康人群。使用R软件对数据进行处理，过滤条件为|logFC|>0.5，P值<0.05，获得RA潜在靶点并分别绘制热图。登录OMIM数据库和Genecard数据库，输入“Rheumatoid arthritis”检索获取RA靶点基因。最后去除重复靶点，整合获得RA靶点。
1.2HQGZ靶点获取及靶点预测 登录TCMSP数据库，分别输入黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣，以口服利用度(OB)>30%，类药性(DL)>0.18为过滤条件进行筛选，并获取其所对应的靶点。通过Uniprot数据库对所获得的基因进行标准化命名。将RA靶点与HQGZ靶点取交集，获取有效靶点。使用Cytoscape软件构建药物-有效成分-靶点网络图。
1.3蛋白互作(PPI)网络构建及拓扑分析 将预测的有效靶点输入String数据库，进行PPI分析，过滤条件为最低互动得分要求>0.9，除去在网络中无连接的点，获得PPI网络图。保存TSV文件，使用Cytoscape软件中的CytoNCA插件进行拓扑分析，过滤条件为中介中心度、接近中心度、程度中心性、特征向量中心度、基于局部平均连接度的方法、信息中心度及网络中心性，每次过滤选取大于中位值的节点，最终获取核心基因。
1.4分子对接验证 将获取的核心基因BC排名前3的靶点与网络图中DC排名前6的有效成分分别进行分子对接验证。登录PDB数据库下载靶点的空间结构，去掉小分子配体。登录Pubchem数据库，下载有效成分2D结构。经Autodock软件处理后获取PDBQT文件，进行分子对接。选取结合能最小的组合使用PYMOL软件绘图。
1.5基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析 将预测的有效靶点通过R软件中的ClusterProfiler包〔10〕对获得的RA潜在靶点进行GO的生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组份(CC)和KEGG通路分析，对P值进行错误发现率(FDR)矫正获得adjP的值，设置阈值adjP<0.05为过滤条件。并绘制排名靠前的通路图。
2.1RA潜在靶点 通过GSE93776、GSE93272的芯片数据对比RA患者与健康人基因差异，分别获取差异基因115个和238个，绘制热图，见图1、图2。登录Genecard数据库、OMIM数据库，输入关键词“Rheumatoid arthritis”，分别获取RA靶点4 157个靶点、48个靶点。删除重复基因，整理后获得4 439个靶点基因。
图1 GSE93272
图2 GSE93776
2.2HQGZ治疗RA有效靶点预测 获取有效成分黄芪20个、桂枝7个、芍药13个、生姜5个及大枣29个，其中槲皮素为黄芪、大枣共有成分，山柰酚为黄芪、芍药共有成分，β-谷甾醇为桂枝、芍药、生姜、大枣共有成分，豆固醇为生姜、大枣共有成分，(+)儿茶素为大枣、桂枝、芍药共有成分，谷甾醇桂枝、芍药共有成分，丁子香萜为黄芪、芍药、大枣共有成分。所对应作用靶点去除重复并经Uniprot数据库标准化命名后共获取213个。将HQGZ靶点与RA靶点取交集获取147个有效靶点。使用Cytoscape软件绘制中药-有效成分-靶点网络图，见图3。发现槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇，芒柄花黄素、异鼠李素、β-胡萝卜素在网络中度值较高，为主要有效成分。
(中心矩形节点为HQGZ中药有效成分，圆形标记中生姜深蓝色，黄芪黄色，桂枝绿色，大枣红色，芍药浅蓝色；
两个同心圆节点为靶点。网络中节点大小与其在网络中的度值呈正相关)图3 中药-有效成分-靶点网络
2.3PPI网络构建及核心靶点筛选 将预测的有效靶点输入String数据库进行PPI网络构建。通过Cytoscape软件进行拓扑分析，筛选出核心靶点JUN、MYC、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)14、MAPK1、RELA、MAPK8、细胞周期素(CCND)1、蛋白激酶B(Akt)1、雌激素受体(ESR)1、肿瘤蛋白(TP)53、连环蛋白(CTNN)β1、NF-κB抑制剂α(NFKBIA)。
2.4分子对接验证 将核心靶点前3的JUN、MYC、MAPK14靶点分别与HQGZ主要有效成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇，芒柄花黄素、异鼠李素、β-胡萝卜素做分子对接。结果见表1。若结合能<0，表明配体分子均能和受体蛋白自发地结合，结合能越小对接越好。据表中数据可知，最低结合能均≤-5.9 kCal/mol，说明配体与受体蛋白结合性良好。其中MAPK14与Beta-carotene对接为最低结合能。
表1 分子对接结果
2.5GO和KEGG通路分析 将有效靶点标注后，作流体切应力与动脉粥样硬化通路图见图4及PI3K-Akt信号通路图见图5。将预测靶点进行GO和KEGG通路富集分析，将富集结果排名靠前的结果作图，见图6，图7。通过GO功能富集分析得到 GO条目2 652个(P<0.05)，其中BP条目2 348个，涉及应激反应、细胞过程、代谢过程、生物调节等方面；
CC条目96个，涉及细胞、细胞组分、细胞器等方面；
MF相关的条目208个，涉及转录调节活性、结合活性、分子功能调节、催化活性等方面。KEGG通路富集分析显示HQGZ治疗RA涉及161条通路，且通路之间相互交叉影响。
图4 流体切应力与动脉粥样硬化通路
图5 PI3K-Akt信号通路
图6 有效靶点GO富集分析
图7 有效靶点KEGG通路富集分析
中医认为素体正气亏虚是RA产生的先决条件，加之风、寒、湿三邪侵袭机体，正气亏虚无力驱邪外出，使病邪稽留体内，病久成瘀，加之湿邪缠绵，因而病势缠绵难愈。首批全国名老中医娄玉铃等〔11〕就曾提出治疗风湿病当从“虚、邪、瘀”三方面出发。HQGZ中以黄芪为君，益气活血、温阳化湿，佐以桂枝温阳散寒、和血通络，合白芍养血缓急，柔筋止痛，重用生姜助桂枝祛风散寒、温经止痛，加以大枣调和脾胃，生化气血，配方精简共奏益气养血、温经通络、和血通痹之功效。
纤维母细胞样滑膜细胞(FLSs)的异常迁移和侵袭是RA最主要的发病机制之一，研究显示〔12〕槲皮素可通过调控miR-146a/GATA6轴抑制FLSs的迁移和侵袭。槲皮素还可抑制IL-17刺激的RA-FLS中RANKL的产生和IL-17刺激破骨细胞的形成，降低Th17的分化〔13〕。有临床研究显示〔14〕每天服用500 mg槲皮素，持续8 w，可以显著改善RA患者的临床症状、疾病活性，降低血浆高敏感性肿瘤坏死因子水平和健康评估问卷评分。同样，山柰酚在治疗RA中可以抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,通过抑制核因子(NF)-κB和Akt/mTOR通路改善炎症RA-FLS〔15〕。另一项研究表明〔16〕，山奈酚可通过阻断MAPK通路的激活抑制了FLSs在RA中的迁移和侵袭。氧化损伤与RA和系统性红斑狼疮的发病机制有关，Comstock等〔17〕曾研究发现，RA或系统性红斑狼疮患者血清中α-生育酚、β-胡萝卜素和视黄醇的浓度低于非RA或系统性红斑狼疮患者，即抗氧化状态是RA的危险因素。筛选出核心靶点后进行分子对接，结果显示受体与配体结合度紧密，从侧面验证了本研究预测的准确性。本研究发现HQGZ治疗RA可能是通过多成分多靶点共同作用，起到抗炎止痛、调节免疫的功效。
RA患者的心血管事件是一般人群的1.5～2.0倍，心血管事件是RA患者死亡的主要原因〔18〕。炎症是RA的一个特征，会导致内皮细胞(ECs)的激活，活化的ECs通过增加白细胞黏附分子的表达而诱发动脉粥样硬化〔19〕。本研究显示HQGZ治疗RA富集程度较高的通路中流体切应力与动脉粥样硬化通路居第一。研究发现内皮细胞通过缝隙连接蛋白血小板/内皮细胞黏附分子1、细胞表面糖萼、初级纤毛、离子通道、小窝和G蛋白、细胞骨架蛋白和整合素〔20,21〕等机械传感器识别切应力。在机械传感的基础上，剪切力通过诱导细胞信号事件的级联和改变基因表达模式来调节内皮功能和结构。其中通过产生和清除活性氧(ROS)和一氧化氮来调节氧化还原平衡是切应力作为一种有效的促动脉粥样硬化或抗动脉粥样硬化刺激的关键机制〔22〕。现已有研究〔23,24〕表明，黄芪桂枝五物汤联合西药在治疗心肌梗死方面能够显著降低氧化应激反应指标水平,降低过氧化损伤程度,保护血管内皮功能，增强治疗效果,改善心功能和中医证候,减少心血管不良事件发生。这也从侧面验证了HQGZ可能在治疗RA过程中不仅能够起到抗炎、调节免疫的功效，也能够改善RA患者的心血管风险，改善患者预后。
PI3K-Akt信号通路是已知与RA发病联系较为密切通路之一。RA的病情进展主要表现为成纤维滑膜细胞大量增殖分化，产生炎症因子及基质金属蛋白酶(MMPs)，激活血小板，并刺激血小板微颗粒向关节腔中释放血小板活化产物，进而激活PI3K/Akt通路，影响多种下游效应分子的激活过程，从而抑制滑膜细胞自噬〔25〕。有研究显示RA患者滑膜细胞中Akt存在过度表达，而PI3K作为Akt的上游分子，能够活化Akt。Akt通过磷酸化激活多种靶蛋白产生抑制细胞凋亡的效应〔26,27〕。因此HQGZ可能通过抑制PI3K/Akt信号通路进而促进成纤维滑膜细胞凋亡并抑制其异常增殖的作用。从通路图中我们可以看到通路涉及多项炎症及免疫相关通路如MAPK信号通路、NF-κβ信号通路、细胞凋亡通路、细胞黏附分子通路、p53信号通路、VEGF信号通路、Toll样受体信号通路等。同时在人类巨细胞病毒感染通路方面，已有研究表明巨细胞潜伏感染的存在会影响RA临床病程和预后〔28～30〕。
本研究可知HQGZ治疗RA是通过多成分多靶点作用于多通路后的共同结果，且在治疗过程中可能会减轻心血管并发症，提高患者预后，这也正体现了中医异病同证、异病同治的思想。本研究结果为今后挖掘HQGZ治疗RA的作用机制提供了理论依据和数据支撑。因数据库使用有限，可能造成结果存在差异，有待进一步实验验证。
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