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孔令春，邹 红，李景景，凌 芸，唐慧新
视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)作为一种缺血缺氧性视网膜血管疾病，黄斑水肿(macular edema，ME)和视网膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)是其最常见的并发症，也是导致RVO患者视力下降的主要原因[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)之间动态的平衡在新生血管形成过程中起着重要的作用[2]，已得到广泛共识。而缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是在缺氧状态下发挥活性的转录因子，是调节细胞内氧代谢的关键物质，能诱导下游基因VEGF的表达[3]，同时也参与PEDF翻译后蛋白水平的下调机制[4]。
桃红四物汤是一种经典的活血化瘀中药方剂，由桃仁、红花、熟地黄、当归、芍药、川芎等6种药材组成。多项研究报道该方治疗心脏、脑等大血管的阻塞效果较好[5-7]。前期研究发现以桃红四物汤为基础方，加上黄芪、枳壳、香附、茯苓、白术、薏苡仁益气利水的中药组成的加味桃红四物汤，灌胃后视网膜静脉阻塞模型大鼠可以减轻视网膜出血、渗出、水肿等眼底病变[8]。为了进一步研究该中药复方对视网膜的保护作用机制，本研究拟建立视网膜Müller细胞缺氧模型，探究加味桃红四物汤含药血清对缺氧条件下视网膜Müller细胞VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α表达的影响，为临床上中药治疗缺血缺氧性视网膜血管疾病提供科学依据。
1.1材料
1.1.1动物与细胞株SPF级健康SD雄性大鼠20只，体质量250±30g，由上海中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0008。于上海中医药大学SPF级实验室常规饲养，饲养温度20℃～25℃，环境湿度50%～60%，自由饮水进食。该实验动物经上海中医药大学实验动物福利与伦理委员批准。rMC-1细胞是一种鼠源视网膜Müller细胞系，为实验室液氮保存。
1.1.2药物加味桃红四物汤组成：黄芪20g，当归12g，生地12g，桃仁9g，红花9g，赤芍12g，枳壳9g，川芎9g，香附9g，茯苓12g，白术10g，薏苡仁20g。总共12味中药，重143g。上海中医药大学附属曙光医院中药房配备。由本院中药制剂室煎制，将上述药材浸泡、煎煮(加水煮沸1h后过滤，滤渣加水煮沸1h，合并二煎的滤液)、去渣，浓缩(90℃)至药液浓度为32g/10mL(含生药)。
1.1.3主要试剂与仪器戊巴比妥钠(10g/L)(批号：Lot.No.WS20160401)购自国药集团化学试剂公司；
DMEM培养基(货号：11885-084，批号：2366072)、胎牛血清(FBS)(货号：10099-141，批号：2021472)均购自美国Gibco公司；
CCK-8试剂盒(货号：CK04-100T)购自日本DOJINDO公司；
PEDF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：SDR0068)、VEGF ELISA试剂盒(货号：SDR0041)、BCA蛋白定量试剂盒(货号：SD0012)均购自上海司鼎生物科技有限公司；
Trizol RNA提取试剂(批号：15596018)购自美国Invitrogen公司；
实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)试剂盒(货号：RR420A)购自日本TAKARA；
引物由上海司鼎生物科技有限公司合成；
STAT3抗体(货号：ab68153)、p-STAT3抗体(货号：ab32143)、HIF-1α抗体(货号：ab179483)均购自美国Abcam公司；
β-actin抗体(货号：SD0034)购自上海司鼎生物科技有限公司。三气培养箱(中国华仪宁创公司，Smartor 118型)。
1.2方法
1.2.1含药血清的制备正常SD雄性大鼠随机分为含药血清组和空白血清组，每组10只。按照每天1mL/100g分别予加味桃红四物汤方中药灌胃，空白血清组给予同等量生理盐水。给药3d，第3d灌胃结束后给予禁食，次日晨再灌胃一次。1h后3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，无菌条件下自后腔静脉采血，静置3～4h，3000r/min、20min、4℃离心，超净台上分离血清，将分离得到的血清置于56℃水浴中30min灭活，微孔滤膜过滤，密封好，-20℃保存备用。临用前用空白血清进行稀释作为含药血清的低、中、高剂量组。
1.2.2Müller细胞培养及缺氧处理rMC-1细胞复苏后，使用添加10%FBS、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，置37℃度培养箱培养(5%CO2，21%O2)，并维持一定的湿度。约1～2d换液1次，细胞生长融合至85%时，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用完全培养基终止消化后，以1∶3比例传代，取对数生长期的3～6代细胞用于实验。缺氧处理为将细胞放入缺氧箱(5%CO2，1%O2)培养6、24、48h。
1.2.3实验分组及干预实验分为五组，即正常对照组，缺氧模型组，加味桃红四物汤低、中、高剂量组，具体干预和培养条件见表1。
表1 各组干预及培养条件
1.2.4CCK-8法检测细胞活力通过CCK-8实验明确加味桃红四物汤含药血清的干预剂量。向96孔板中每孔接种细胞悬液100μL，使每孔细胞数目至1×105个，然后将96孔板放在培养箱中(37℃, 5%CO2的条件下)常规培养24h，各组细胞按照分组干预后，每组设6个复孔，向每孔中加入10μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育3h，用酶标仪检测450nm处的OD值。
1.2.5ELISA检测VEGF和PEDF分泌收集各组细胞上清液按试剂盒说明操作，每组设3个复孔，在阳性对照正常显色的前提下，根据说明书对VEGF、PEDF的含量进行测量。
1.2.6Westernblot检测p-STAT3和STAT3及HIF-1α蛋白的表达收集各组rMC-1细胞，按照蛋白抽提试剂盒说明抽提细胞总蛋白，并采用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，每组分别取20μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜后分别加入p-STAT3、STAT3和HIF-1α一抗体稀释度分别为1∶2000、1∶2000、1∶1000，以抗体稀释液配制，4℃孵育过夜；
TBST洗膜3次，随后加入HRP标记的与一抗相对应二抗(1∶20000)，37℃孵育1h。显色定影之后，用ImageJ图象处理系统分析目标蛋白条带的灰度值，蛋白表达量结果以灰密度比值(目的蛋白/β-actin)表示。
1.2.7RealtimePCR检测VEGF、PEDF、STAT3和HIF-1αmRNA水平收集各组rMC-1细胞，使用Trizol提取细胞总RNA，测定RNA的质量和浓度。应用逆转录试剂盒将mRNA合成为cDNA，随后依照RT-qPCR试剂盒进行VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α mRNA扩增，以GAPDH为内参，引物序列见表2。每个样品设置3个复孔，反应体系为：cDNA 1μL，上下游引物各1μL，2×Green Mix 10μL，去离子水7μL。反应条件设置为：95℃ 30s；
95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环，使用相对表达量2-ΔΔCt法进行分析。
表2 引物序列
2.1不同时间各组对缺氧损伤rMC-1细胞活力的影响CCK-8结果显示(图1)：在1%O2条件下培养48h，与正常对照组相比，缺氧模型组rMC-1细胞活力明显受到抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。与缺氧模型组相比，加味桃红四物汤含药血清低、中剂量组均可以改善rMC-1细胞缺氧48h的细胞存活率，差异均有统计学意义(P<0.05)，而高剂量组对rMC-1细胞缺氧48h的细胞存活率无改善作用，差异无统计学意义(P>0.05)，故选用加味桃红四物汤含药血清低、中剂量组和缺氧48h用于后续实验。
图1 不同时间各组对缺氧损伤rMC-1细胞活力的影响 A:6h;B:24h;C:48h; aP<0.05 vs 正常对照组; cP<0.05 vs 缺氧模型组。
2.2各组对缺氧损伤rMC-1细胞VEGF和PEDF分泌的影响ELISA结果发现：与正常对照组比较，缺氧模型组细胞上清液VEGF蛋白表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05)，而PEDF蛋白表达量下降，差异有统计学意义(P<0.05)，加味桃红四物汤低、中剂量均可减少缺氧条件下rMC-1细胞VEGF的蛋白表达量，差异均有统计学意义(均P<0.05)，但不能增加PEDF的蛋白含量，差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，加味桃红四物汤含药血清对rMC-1细胞缺氧48h VEGF的分泌有抑制作用，低剂量作用优于中剂量，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。
图2 各组对缺氧损伤rMC-1细胞VEGF和PEDF分泌的影响 A：ELISA检测VEGF浓度；
B:ELISA检测PEDF浓度；
aP<0.05 vs 正常对照组; cP<0.05 vs 缺氧模型组；
eP<0.05 vs 加味桃红四物汤低剂量组。
2.3各组对缺氧损伤rMC-1细胞p-STAT3、STAT3、HIF-1α蛋白的影响Western blot结果发现：与正常对照组比较，rMC-1细胞缺氧培养48h后，p-STAT3和HIF-1α的蛋白表达显著上调，差异均有统计学意义(P<0.05)，而加味桃红四物汤低、中剂量对两者在蛋白水平较缺氧模型组均有下调作用，差异均有统计学意义(P<0.05)，且低剂量组抑制作用均优于中剂量，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与正常对照组比较，rMC-1细胞缺氧培养48h后，STAT3的蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，而加味桃红四物汤含药血清中剂量对其在蛋白水平较缺氧模型组有上调作用，差异有统计学意义(P<0.05)。表明加味桃红四物汤含药血清可减少缺氧48h后rMC-1细胞STAT3的磷酸化，减少HIF-1α的蛋白表达，见图3，表3。
图3 Western blot检测各组rMC-1细胞中p-STAT3、STAT3、HIF-1α蛋白表达条带图。
表3 各组对rMC-1细胞缺氧48h p-STAT3、STAT3、HIF-1α蛋白表达的影响
2.4各组对缺氧损伤rMC-1细胞VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α基因表达的影响Real time PCR结果表明：与正常对照组比较，rMC-1细胞缺氧培养48h后，VEGF、STAT3和HIF-1α的基因表达上调，差异均有统计学意义(P<0.05)，PEDF的基因表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而加味桃红四物汤低、中剂量对VEGF在基因水平较缺氧模型组均有下调作用，差异均有统计学意义(P<0.05)，对PEDF在基因水平较缺氧模型组均有上调作用，差异均有统计学意义(P<0.05)，且低剂量组优于中剂量，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与缺氧模型组相比，加味桃红四物汤低剂量对STAT3和HIF-1α在基因水平均有下调作用，差异均有统计学意义(P<0.05)，但其中剂量对两者在基因水平无下调作用，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。结果表明，低剂量加味桃红四物汤含药血清可以抑制缺氧损伤rMC-1细胞VEGF、STAT3、HIF-1α mRNA的高表达，增加PEDF mRNA的表达。
表4 各组对rMC-1细胞缺氧48h VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α mRNA表达的影响
Müller细胞作为视网膜上特有的也是极为重要的一种神经胶质细胞，占视网膜胶质细胞的90%，它通过分泌VEGF等多种细胞生长因子，参与视网膜新生血管的形成[9]。正常情况下它也会分泌PEDF，而PEDF是一种对新生血管形成有抑制效应的细胞因子[10]，来拮抗VEGF的血管损伤作用以维持平衡状态。缺血缺氧会诱导大量VEGF反应性增高，PEDF表达下降[11]，二者平衡被打破，从而形成各种病理性新生血管[12-13]。Wolfram等[14]证实，在缺氧条件下，Müller细胞内VEGF 基因及蛋白表达升高，PEDF 基因及蛋白表达降低，引起视网膜新生血管的形成。本研究选用Müller细胞作为模型细胞。
VEGF是一种促血管生成因子，在ME和RNV的发生发展中起关键作用[15-16]。目前针对以上两种并发症的一线治疗是玻璃体内注射抗VEGF药物，这为广大患者带来了福音，但其给药方式为眼球内注射，属侵入性治疗，增加了眼内感染的机率，且有研究显示，尽管采取定期多次抗VEGF治疗，仍有约25%患者的视力或黄斑水肿程度得不到明显的改善[17]。在抗VEGF基础上联合中医中药治疗RVO有提高疗效，减少用药次数的优点[18-19]，亦有学者发现单味中药含药血清可以抑制缺氧下视网膜色素上皮细胞的VEGF分泌[20]，因此，传统医学治疗视网膜血管病越来越受到学者们广泛关注。RVO是由视网膜静脉的血栓引起的，属中医“络损暴盲”范畴，活血化瘀贯穿其整个治疗过程，若并发黄斑水肿，可配伍益气、利水的中药。本课题组前期研究发现，加味桃红四物汤(原名行气活血健脾利水方)治疗气虚血瘀的RVO患者可提高视网膜静脉阻塞患者的视敏度，减轻视网膜黄斑水肿，增加眼部血流，改善视网膜的微循环[21]；
还可以减轻RVO模型大鼠视网膜出血、水肿等眼底病变，具有良好的改善视网膜水肿的作用[8]。方中黄芪、当归为君药，益气活血；
生地黄、赤芍凉血活血，川芎、香附、枳壳行气活血，白术、茯苓、薏苡仁健脾利水，同为臣药；
佐以桃仁、红花活血化瘀，全方共奏活血化瘀和健脾利水之功。
本研究用加味桃红四物汤含药血清干预缺氧培养的Müller细胞，发现缺氧培养后该细胞活力受到明显抑制，而含药血清低、中剂量均可以改善缺氧后Müller细胞的活力。研究还发现，与正常对照组比较，缺氧模型组VEGF分泌和基因表达增加，而PEDF分泌水平和基因表达下降，加味桃红四物汤含药血清低、中剂量均可以减少VEGF分泌和基因表达，表明加味桃红四物汤对Müller细胞缺氧条件下VEGF的分泌和基因表达均有抑制作用，且低剂量组的抑制作用优于中剂量组，其原因可能是因为Müller细胞在缺氧刺激下其活力下降导致对药物的吸收率下降。值得注意的是，加味桃红四物汤含药血清可上调PEDF的基因表达，但却不能促进PEDF的分泌，考虑原因可能有两方面：(1)PEDF的表达水平可能具有滞后性，张梅虹等[22]也发现高氧诱导早产儿视网膜病变模型小鼠血清PEDF水平的变化滞后于视网膜PEDF的改变；
(2)蛋白翻译是多步骤调控的结果，本实验的加味桃红四物汤是多种药物的复方制剂，可能存在某些单体成分在PEDF的蛋白翻译水平起到抑制作用，需要对该复方的有效成分进一步研究。
HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β组成的异二聚体，HIF-1αmRNA既是HIF-1的调节亚基，又是活性亚基，其蛋白稳定性及转录活性均受到氧分压的严格调控，属于氧调节蛋白，故HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1α[23]。有研究表明，在缺氧时，STAT3被激活[24-25]，激活的STAT3通过增加HIF-1α的稳定性和转录活动上调HIF-1α的表达[26]。利用shRNA干扰缺氧条件下人角膜上皮细胞HIF-1α表达，能有效地抑制VEGF mRNA和蛋白表达，使PEDF mRNA和蛋白表达上调[27]，提示PEDF和VEGF的调控均受HIF-1α的调控。本研究发现，与正常对照组比较，Müller细胞缺氧培养后，p-STAT3和HIF-1α的蛋白和基因表达显著上调，而低剂量含药血清对两者在蛋白和基因水平均有下调作用；
与正常对照组比较，Müller细胞缺氧培养后，STAT3的蛋白表达无明显变化，而中剂量含药血清对其在蛋白水平有上调作用。表明加味桃红四物汤含药血清可减少缺氧后Müller细胞STAT3的磷酸化，减少HIF-1α的蛋白表达。
综上所述，加味桃红四物汤可改善缺氧损伤的视网膜Müller细胞rMC-1活力下降，抑制其VEGF分泌，下调VEGF的基因表达，上调PEDF基因表达，维护了两者的平衡，进而可能抑制视网膜新生血管，减轻视网膜水肿，发挥治疗RVO的作用，其作用机制可能与抑制STAT3/HIF-1α通路有关。
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