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王 雨， 黄晓岚， 张楚晗， 曲星伊， 郭晨雪， 陈 焰， 范亚新， 郭蓓宁， 张 菁， 刘笑芬
多黏菌素B是治疗广泛耐药革兰阴性菌的最后一道防线。肾毒性是多黏菌素B的主要不良反应，发生率高（38%），临床应用被限制[1]。多黏菌素类药物合理应用国际指南中指出，多黏菌素B稳态血药浓度在2～4 mg/L，体内暴露量药时曲线下面积（AUC）在50～100 mg·h/L范围内有较好的疗效，超上限时，则会明显增加毒性发生风险[2]。多黏菌素类药物治疗窗窄，肾毒性发生率高，个体差异大，推荐进行治疗药物监测（TDM），指导临床合理用药，对于提高疗效、降低不良反应发生率、减缓耐药具有重要意义[3]。
TDM的实施需要生物样本分析方法的支持。多黏菌素B作为30多种成分组成的混合物，且无发光基团，为分析方法的建立带来严峻的挑战。早期，多黏菌素B的分析方法有毛细管电泳、薄层色谱、高效液相色谱-紫外检测/荧光检测(HPLC-UV/FD)等[4-7]，但灵敏度低、特异性差，且耗时。近年来，灵敏度高、特异性好且高效的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法常用于多黏菌素B浓度测定。Cheng等[8]对大鼠血样采用三氯乙酸(TCA)进行蛋白沉淀并作为离子对试剂，但缺少基质效应考察。Thomas等[9]将建立的LC-MS/MS法成功用于患者血样中多黏菌素B1和B2测定，但线性范围窄（0.1～2.5 mg/L），且溶血和脂血会干扰目标物的测定。Covelli等[10]开发的LC-MS/MS法可测定不同基质中（阳离子调节肉汤、人及大鼠血浆）的多黏菌素B1和B2，但分析时间较长（20 min）。Meng等[11]和Hee等[12]开发的LC-MS/MS法可同时测定至少3种多黏菌素B的组分（B1/B2/B1-Ile/B3）， 并将分析时间缩短至5.5～6.5 min，但前者以TCA作为离子对试剂被添加至流动相和处理样品，后者则采用复杂且昂贵的固相萃取法处理样品。Liu等[13]将分析时间缩短至3 min，且可同时测定人血浆和尿液中的多黏菌素B1和B2，并在尿液中添加0.1%～1%牛血清蛋白来避免多黏菌素B的非特异性吸附，但使用了复杂且昂贵的固相萃取法，不利于TDM的常规开展。邓阳等[14]采用乙腈对血样进行蛋白沉淀处理，并扩大线性范围（B1：0.033～18.816 mg/L，B2：0.034～19. 872 mg/L），但分析时间（10 min）相对较长。
为此本研究在实验室前期已发表的多黏菌素B分析方法[13]基础上优化预处理方法、色谱条件、线性范围等，获得一种快速、简便、灵敏度及准确度高的LC-MS/MS法同时测定人血浆中的多黏菌素B1（含B1-l）和B2，且根据9012生物样品定量分析方法验证指导原则（《中华人民共和国药典》）[15]进行方法学验证，并应用于多黏菌素B在临床上的TDM。
1.1 药品和试剂
多黏菌素B，其中B1含量为73.4%，B1-l含量为8.6%， B2含量为9.0%，批号为R046V0，购自USP（United States Pharmacopeial Convention，Inc.）；
多黏菌素E2含量为100%，来源于上药第一生化研究所；
乙腈（德国默克公司）为色谱纯；
甲酸（德国Sigma-Aldrich 公司）为分析纯；
超纯水由法国Millipore超纯水系统制备；
2 mL 96孔收集板购自美国Waters公司。空白血浆留取经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准（2019临审第310号），为EDTA-K2抗凝。
1.2 仪器
液相色谱系统为HPLC高效色谱，美国AB SCIEX公司；
质谱系统为API 4500型三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源（ESI源），美国AB SCIEX公司；
Analyst 1.6.3数据采集软件，美 国AB SCIEX公 司；
Mettler Todelo XS 205电子分析天平，瑞士梅特勒公司；
控温高速离心机（LEGEND MICRO 17R），德 国Thermo Fisher公司；
－70℃低温冰箱（Thermo Forma 900），美国Thermo Fisher公司。
1.3 液相及质谱条件
色谱柱选用PhonomenexKinetex XB-C18柱（100mm×2.1 mm I.D.， 2.6 μm），且 柱 温 为（40.0±5.0）℃；
流动相由0.2%甲酸-乙腈（A相）和0.2%甲酸水溶液（B相）组成，且流速为0.4 mL/min；
自动进样器设定温度为（10.0±5.0）℃；
进样量为5.0 µL；
梯度洗脱，如下：0～2.5 min，10%升 至35%A相；
2.5～2.9 min，35%A升 至70%A；
2.9～3.0 min，70%A降至10%A；
3.0～3.5 min，维持10%A。
电喷雾电离源(ESI)；
正离子多反应监测模式；
多黏菌素B1、B2和多黏菌素E2的离子对分别为m/z 602.6→m/z 241.1、m/z 595.5→m/z 227.1和m/z 578.5→m/z 101.2；
三个化合物的扫描时间、去簇电压及碰撞能量相同，分别为200 ms、80V、23V。
1.4 标准曲线、质控样品和内标工作溶液配制
精密称量多黏菌素B对照品两份，分别加0.2%甲酸水配制B1（含B1-l）浓度为1 000 mg/L标准曲线和质控储备液。将标准曲线和质控储备液用0.2%甲酸水稀释至一定浓度的标准曲线和质控系列工作溶液，再用空白血浆样品分别稀释20倍后获得标准曲线和质控样品。标准曲线样品多黏菌素B1（含B1-l）/B2浓度分别为0.050 0/0.005 49、0.100/0.011 0、0.200/0.022 0、0.400/0.043 9、0.800/0.087 8、1.25/0.137、2.50/0.274、5.00/0.549、10.00/1.098 mg/L。质控样品浓度分别为0.150/0.016 5、0.800/0.087 8、8.00/0.878 mg/L。
另外精密称量多黏菌素E2对照品，加0.2%甲酸水配制成10 000 mg/L的内标储备液，再以0.2%甲酸水稀释，获得浓度为5.0 mg/L的内标（IS）工作溶液。
1.5 血浆样品预处理
精密吸取100 µL血浆样品到2 mL EP管中加入50 µL IS工作溶液，再加入6%甲酸水50 µL涡旋混匀，再加入300 µL乙腈涡旋混匀。12 000 r/min、4℃离心10 min后吸取上清液200 µL至96孔板中，再加入300 µL 6%甲酸水，混匀，进样5 µL。
1.6 方法学考察
分别对来源于3个不同健康志愿者和3个不同老年肺炎患者的空白血浆样品进行选择性考察。与LLOQ样品的出峰位置以及峰面积比较，观察空白血样是否在待测物及内标出峰处存在干扰。多黏菌素B1（含B1-l）/B2标准曲线血浆样品的浓度分别是0.050 0/0.005 49、0.100/0.011 0、0.200/0.022 0、
0.400/0.043 9、0.800/0.087 8、1.25/0.137、2.50/0.274、5.00/0.549、10.00/1.098 mg/L。多黏菌素B1/B2血浆的LLOQ浓度为0.050 0/0.005 49 mg/L。以血浆多黏菌素B1/B2浓度为横坐标（x），多黏菌素B1/B2峰面积与内标多黏菌素E1峰面积的比值为纵坐标（y），用加权（W = 1/x2）最小二乘法进行回归运算，相关系数为R2。另配制多黏菌素B 的LLOQ和质控样品，在同一批次内每个浓度重复6样本，在至少2 d内连续测定3个批次，分别计算批内和批间精密度[用变异系数（CV）表示]和准确度 （RE）。
考察健康者空白血浆、患者空白血浆、溶血、脂血及患者血清等不同基质对多黏菌素B及内标响应的影响以及提取回收率。处理6个不同来源的空白血浆（3份正常空白血浆和3份患者空白血浆）、1份空白溶血、1份空白脂血及3份患者血清，离心后的上清液与6%甲酸水按2∶3混合后，分别加入低、中、高浓度的质控工作溶液和IS工作溶液，混匀后即得空白基质含药溶液。将以上低、中、高浓度的质控工作溶液和IS工作溶液用6%甲酸与乙腈的混合溶液稀释至相同浓度，即得含药溶液。分别计算低、中、高浓度下的内标归一化的基质效应因子（待测物峰面积比值/内标峰面积比值×100%，其中峰面积比=空白基质含药溶液峰面积/含药溶液峰面积）。另用混合空白血浆配制低、中和高浓度的质控样品，各平行处理6份，同时配制混合空白血浆处理后添加含药溶液样品（6份）。分别计算多黏菌素B低、中、高浓度下的提取回收率[提取回收率=质控样品处理后待测物的面积/混合空白基质处理后加含药溶液面积平均值×100% （n=6）]。基质效应和提取回收率分别计算变异系数，要求＜15.0%。
1.7 TDM的临床应用
我们开展了广泛耐药革兰阴性菌感染患者（包含儿童和老年）中多黏菌素B TDM等临床研究，并均已通过复旦大学附属华山医院伦理委员会批准（批件号：2020临审第668号；
2020临审第847号；
2020临审第831号修正1）。应用多黏菌素 B 治疗的患者在药物达稳态（一般第4剂及以后）用药前和结束后 0.5 h内分别采集其谷、峰血样；
若多黏菌素 B 给药方案需进行调整，于调整后第 2～3剂静脉滴注前和静脉滴注结束后 0.5 h内采集谷浓度和峰浓度样品。采血管为紫帽管（EDTA K2抗凝），采集1～2 mL全血，在3 500 r/min 4℃下离心10 min，取全部上清液于血样保存管，于-70 ℃冷冻保存至检测。
2.1 方法学验证
3个不同健康者和3个不同患者的空白血浆及混合空白血浆在多黏菌素B1、B2和内标出峰处均未见干扰峰，表明空白血浆中的内源性物质不干扰目标化合物的测定。LLOQ样品中多黏菌素B1、B2和内标峰形对称，分离良好，保留时间分别为2.02、1.86、1.72 min（图1和图2）。血浆样品中的多黏菌素B1和B2分别在0.05～10.0 mg/L和0.005 49～1.098 mg/L浓度范围内线性良好，相关系数（R2）均大于0.99。典型标准曲线回归方程：多黏菌素B1，y= 0.984x－0.002 29 （R2= 0.996 8）；
多黏菌素B2，y= 2.45x＋ 0.001 1 （R2= 0.989 2）。
图1 多黏菌素B1和内标典型血浆色谱图Figure 1 Representative chromatograms of polymyxin B1 （PMB1） and internal standards （PME2） in blank human plasma
图2 多黏菌素B2和内标典型血浆色谱Figure 2 Representative chromatograms of polymyxin B2 （PMB2） and internal standards （PME2） in blank human plasma
准确度与精密度数据见表1。多黏菌素B1 LLOQ样品批内、批间精密度分别为13.1%和15.4%，准确度分别为117.7%和106.6% 。多黏菌素B1的质控（低、中、高浓度）样品批内精密度均≤5.9%，批间精密度均≤14.0%，准确度在100.9%～110.8%范围内。多黏菌素B2 LLOQ样品批内批间精密度分别为16.0%和19.3%，准确度分别为107.0%和91.6%。多黏菌素B2的质控（低、中、高浓度）样品批内精密度均≤10.6%，批间精密度均≤14.8%，准确度在97.6%～100.7%范围内以上结果均符合生物样本测定相关要求[15-17]。
表1 血浆中多黏菌素B1、B2的批间及批内精密度和准确度Table 1 Accuracy and precision for polymyxin B1 and B2 assay in human plasma
多黏菌素B1健康者和患者血浆内标归一化的基质效应因子为92.6%～103.0%；
溶血血浆内标归一化的基质效应因子为102.4%～112.6%；
脂血血浆内标归一化的基质效应因子为99.9%～104.7%；
患者血清内标归一化的基质效应因子为97.1%～106.3%。多黏菌素B2健康者和患者血浆内标归一化的基质效应因子为73.6%～94.6%；
溶血血浆内标归一化的基质效应因子为85.6%～120.6%；
脂血血浆内标归一化的基质效应因子为89.7%～103.4%；
患者血清内标归一化的基质效应因子为82.6%～93.4%。以上所有的精密度均＜15.0%。结果表明，在本研究中可忽略基质效应对待测物及其内标的影响（表2）。血浆样品中多黏菌素B1和B2的提取回收率分为79.1%～80.6%和83.2%～87.8%，精密度≤14.6%。
表2 多黏菌素B1/B2在血浆中基质效应和回收率Table 2 The extraction recovery and internal standard normalized matrix effect of polymyxin B1 and B2 in human plasma（%）
2.2 TDM
采用本研究所建立的方法，对临床55例感染患者进行多黏菌素B用药后TDM，其中包括中青年患者20例、老年患者（65岁以上）20例，儿童患者（18 d～14岁）15例，中青年、老年患者和儿童患者的给药剂量分别为50～75 mg、40～75 mg和0.88～2.22 mg/kg每12小时1次。多黏菌素B在中青年、老年和儿童患者中的血药浓度分布见图3。
图3 多黏菌素B在中青年、老年与儿童患者中的血药浓度Figure 3 The trough and peak plasma concentrations following different doses of polymyxin B in adult， elderly and pediatric patients
本实验室前期建立了LC-MS/MS法同时测定人血浆和尿液中的多黏菌素B1和B2浓度，应用于多黏菌素B临床药动学研究和TDM[13]。样品预处理方法采用固相萃取法，操作相对复杂，且成本高，不利于广泛开展多黏菌素B的TDM[11]。有报道采用TCA作为沉淀剂处理生物样品，但会影响目标化合物的质谱信号且腐蚀性强，较危险。本研究对样本预处理方法进行优化，选用乙腈作为沉淀剂，操作简单且成本低。
在离子对的选择上，多黏菌素B的主要成分多黏菌素B1、B2，在LC-MS/MS中可以监测到［M + 2H］2+及［M + 3H］3+母离子，其中带三电荷母离子的离子对响应更高，可以根据灵敏度需求选择合适的离子对进行测定[14]。在方法开发中，发现带三电荷离子通道的干扰峰明显，需要较长分析时间将其色谱分离，因此本方法采用带双电荷离子进行定量分析。内标的选择在LC-MS/MS方法的建立中非常重要，通常同位素内标是LCMS/MS方法的首选，然而鉴于多黏菌素B的结构复杂，合成同位素内标价格昂贵，因而可选择其结构类似物作为内标[18]。多黏菌素E作为多黏菌素B的结构类似物，在性质上与多黏菌素B相似，其纯品多黏菌素E1或多黏菌素E2均可以作为内标[10，13]。多黏菌素E的混合物不推荐作为内标，其成分复杂会在质谱中产生离子通道间交互影响，干扰多黏菌素B的测定，对色谱条件要求较高。
相比于样品处理更干净的固相萃取法，蛋白沉淀法需注意在检测过程中基质效应的影响。由于建立方法的过程中通常采用健康受试者血清或血浆，而临床患者血样通常由于疾病、用药等影响，血样测定过程中可能带来基质效应影响[19-20]。本方法在进行基质效应考察时，为模拟真实样品，除健康者空白血浆样品、溶血以及脂血样品外，还增加3个不同来源临床患者的空白血浆样品。基质效应结果显示，临床患者血浆样本中内源性物质及合并用药不干扰多黏菌素B的质谱响应。同时，在临床采集多黏菌素B的TDM血样时，临床可能易错用为促凝剂管。本研究还选用3个不同来源临床患者的空白血清样品，考察其对多黏菌素B质谱信号的影响。血清样品基质效应结果表明，本方法可直接用于人血清样品中的多黏菌素B浓度测定，与邓阳等[14]报道的结果一致。
多黏菌素B纯水溶液在LC-MS/MS测定过程中发现会吸附在玻璃或塑料制品壁上，导致方法建立或者测定不准确。通常在纯水溶液中加入一定比例的表面活性剂、有机溶剂、酸或蛋白溶液，都能够有效预防吸附的发生[11，13]。所以，本方法不可直接用于测定蛋白质少的基质样品，如脑脊液、尿液、肺泡灌洗液，需提前添加防吸附剂来确保测定结果的准确性。
本研究建立了一种简单、快速、灵敏度高和准确性好的LC-MS/MS法，用于人血浆中多黏菌素B中主要成分B1和B2浓度的测定，可为该药在患者包括成人、老年及儿童患者中的TDM提供简单、快速检测方法。
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