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刘云，叶进培，郭兴萍
（1.山西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001；
2.山西大学 生物医学研究院，山西 太原 030006；
3.山西白求恩医院（山西医学科学院），山西 太原 030032）
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是存在于人和动物的多种器官组织中（如骨髓、脂肪、脐带、胎盘等）成纤维状的贴壁细胞，在特定条件下可以诱导分化形成多种功能的细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等。由于它具有自我更新、多项分化潜能、低免疫原性和免疫调控以及向缺血或损伤组织归巢等特性，对多种疑难疾病的靶向治疗和免疫治疗有重大意义。2006年国际细胞治疗学会（ISCT）［1］确定人间充质干细胞（hMSC）的鉴定标准为：（1）在塑料培养皿内贴壁生长，在含血清培养基内，高度增殖；
（2）表达CD105、CD73、CD90，不 表 达 CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79ɑ或 CD19 和 HLA-DR；
（3）在体外可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
虽然骨髓MSC较为常见，但含量很低，占骨髓单核细胞的0.000 1%～0.01%，且分离和提纯的难度较大，取材时对人体损伤较大，从而限制了骨髓MSC在临床中的应用。相比于人骨髓MSC，人脂肪间充质干细胞（Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell，hADSC）取材时对捐赠者创伤较小，而人脐带间充质干细胞（Human Umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）取材更为方便，且具有旺盛的自我更新能力及多向分化潜能，可以大规模的分离，是目前MSC用于细胞移植和临床治疗的主要种子细胞［2-6］。然而骨髓、脂肪、脐带等组织来源的MSC，由于组织捐献者或取材部位的不同会导致细胞特性和功能存在差异，影响临床研究与应用。全能干细胞如人胚胎干细胞（Human Embryonic Stem Cell，hESC）和重编程诱导干细胞（Human Induced Pluripotent Stem Cell，hiPSC）是一种来源单一且品质高度相同的高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化衍生成包括间充质干细胞（Human Embryonic Stem Cell derived Mesenchymal Stem Cell，hESC-MSC）在内的多种细胞［7］。因此用人全能干细胞衍生的MSC作为新的种子细胞来源，具有单一的遗传及生物学背景，便于细胞的质量控制以及标准化、规模化的生产，有望成为理想的临床（药物）细胞制剂用于治疗多种病症。
迄今关于MSC的临床研究报道已有大量报道（www.clinicaltrials.com），但是大都处于临床实验的初期，对MSC在体内的治疗作用机制仍不清晰。为了深入研究MSC在体内的作用机理，需要掌握其植入体内后的行踪，直观、实时的检测MSC在体内的分布、转归、融合及存活状态等；
干细胞标记体内示踪是有效的研究途径［8］。MSC标记示踪方法主要有荧光蛋白法、荧光染料法、抗原法、磁共振成像法（MRI）等［9］，而抗原法会使结果出现假阳性，且检测起来相对费时费力［10］；
MRI的不足是造影剂会对机体产生不良影响，而且同样会出现假阳性结果［11］；
荧光染料法由于经过染料标记的细胞被巨噬细胞吞噬后，细胞碎片在巨噬细胞内也可荧光表达，还可使细胞周围的其他细胞出现假阳性，不宜用于细胞长期示踪［12］。荧光蛋白可自发产生荧光，通过荧光显微镜就能直观检测到，其中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）较为常用，该蛋白质在蓝色光线波长范围下激发会发出绿色荧光［13-14］，它由于不需要任何额外的底物来激发信号，不会出现假阳性结果，且易于检测等优势在细胞标记示踪领域应用广泛［15］。因此，干细胞标记绿色荧光蛋白体内示踪是有效的研究途径。
目前关于干细胞绿色荧光蛋白标记示踪的研究主要集中在动物MSC，如大鼠、比格犬、兔的骨髓和脂肪间充质干细胞［16-18］。MSC绿色荧光蛋白标记示踪虽然有一些对人成体组织来源间充质干细胞的报道，但对标记细胞的生物学特性分析尚不全面，缺乏对多种不同来源的间充质干细胞病毒载体转导效率或绿色荧光蛋白标记效率的评价。Stepniewski等［19］比较了hADSCs-Luc-GFP和体外生成的心肌细胞在心肌梗死细胞治疗模型中的效果；
Gao等［20］将标记GFP基因的hADSC移植到脊髓损伤小鼠进行示踪证明了移植的人类细胞在宿主脊髓组织中的长期存活、成功的神经转换和功能整合。Stepniewski等［19］和 Gao 等［20］在 植 入 其 GFP+hADSC前均没有对GFP+hADSCs进行生物学特性分析，无法确保hADSC标记GFP基因后生物学特性没有改变，且不会影响之后的示踪结果。曹慧玲等［21］探讨了hUC-MSC标记GFP前后的形态变化，发现与未转染的细胞无差别；
而王巍巍等［22］虽然对hADSC标记GFP前后的成脂、成骨及增殖能力进行了分析，但缺乏对细胞表型、成软骨分化影响的探究。关于人的全能干细胞，特别是有关hESC衍生的hESCMSC的GFP标记的研究尚未见报道。hESCMSC作为一种新颖的种子细胞来源，具有巨大的临床应用潜力。本实验室最近建立了一种独特、高效的hESC-MSC分化制备方法，分化出的hESC-MSC在增殖、多项分化潜能及免疫调节功能方面都比hUC-MSC更为高效［23］。本研究针对该新颖MSC细胞（hESC-MSC），对照有关组织来源间充质干细胞包括hUC-MSC、hADSC进行了由慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因标记，并全面分析和比较了它们的生物学特性及其慢病毒转导效率。
1.1 主要试剂及仪器
细胞培养液DMEM高糖（博士德）、细胞培养液DMEMF/12（Gibco）、细胞培养液MSCBM（达科为）、明胶（索莱宝）、胎牛血清（Gibco）、胰蛋白酶（Gibco）、嘌呤霉素（索莱宝）、PEI转染试剂（Polysciences）、助转导增强剂polybrene（吉凯基因）、柱式质粒 DNA提取试剂盒（生工）、0.45 μm滤膜（生工）、茜素红、阿利新兰染色液、油红O染色液均购自索莱宝，成脂/成骨/成软骨诱导分化试剂盒（ScienCell）、CCK-8（博士德）、流式抗体（BD Biosciences）；
流式细胞仪（BD LSFortessa X-20）、细胞培养箱（Eppendorf）、生物安全柜（海尔）、Nano-Drop核酸定量仪（Thermo Fisher）。
1.2 研究方法
1.2.1 细胞、质粒来源与细胞培养
本研究所涉及的人体组织和细胞生物医学研究项目均已得到山西大学，山西医科大学学科伦理审查委员会批准。分别是“人脐带胎盘细胞成分的分离和特性研究”（编号：SXULL2019067）；
“由人类胚胎干细胞衍生具有临床兼容性且可移植的多能造血干细胞的研究”（山西医科大学伦理审查委员会）。
hUC-MSC在本实验室前期已经成功分离与扩增，hESC-MSC在本实验室前期也已成功制备并扩增培养［23］。hUC-MSC和hESC-MSC的传代培养使用DMEM/F12+质量分数10%FBS，分别选用第3-6代和第10-20代，它们均为单层贴壁细胞，成纤维样细胞形态；
经流式细胞仪表面抗原检测，均阳性高表达CD73、CD90、CD105，阴性表达 CD34、CD11b、CD19、CD45 和 HLA-DR［23］；
hESC-MSC 和hUC-MSC经成脂、成骨和成软骨分化培养液诱导之后都具有分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的能力，均符合间充质干细胞2006年国际最低标准［1］。
hADSC的分离、培养和定性：抽脂获得的脂肪样品（太原美欧华整形医院志愿者）。在生物安全柜中无菌条件下用含2×双抗（100 U/mL青霉素和100 ug/mL链霉素）的生理盐水清洗4～6遍至清洗液清亮。添加等体积的胶原酶I（质量分数0.1%），置于恒温振荡器，37℃消化60 min，在离心机上1000 r/min离心5 min，弃上清。用达科为（DKW）培养液重悬细胞团（脂肪基质血管细胞成分，SVF），将重悬细胞液再用100 μm细胞筛网滤后将滤液在离心机上1000 r/min离心5 min，弃上清后铺至六孔板培养（第0代），3×105个/孔，每2 d～3 d换一次液，选用第3-6代hADSC用于实验。其三系分化潜能（成脂、成骨和成软骨）测定方案参见本实验室前期工作［23］。
293T细胞株、pLVX-IRES-Puro-GFP主质粒和pSPAX、pMD2.G包装质粒由山西大学生物医学研究院吴长新教授实验室惠赠。
1.2.2 293T细胞的复苏培养
将冻存的293T细胞从-80℃冰箱取出，浸入37℃恒温水浴锅中使其融化。待完全融化后取出细胞，转移至15 mL离心管内，再加入3倍的DMEM高糖细胞培养液，轻轻吹吸混匀，1000 r/min离心5 min，重复离心1次，吸走上清液，加入1 mL培养液重悬细胞，以8×103cell/cm2的密度接种至细胞培养瓶，置于37℃培养箱培养，1 d～2 d更换1次细胞培养液，待细胞贴壁融合度达到90%左右，用胰蛋白酶消化、1000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入1 mL细胞培养液重悬，将细胞仍以8×103cell/cm2的密度接种至新的细胞培养瓶，置于37℃培养箱继续培养。
1.2.3 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒系统的构建
293T细胞生长状态良好且融合度达到60%～70%，在灭菌的1.5 mL EP管中加入主质粒和包装质粒共 5 μg，再加入 15 μL PEI转染试剂和500 μL无血清DMEM 高糖培养液，轻柔混匀，室温下孵育20 min。将293T细胞原培养液弃去，加入孵育好的转染液，再加入4.5 mL新鲜细胞培养液，轻轻混匀，置于37℃培养箱培养。24 h后取出培养瓶吸取4 mL的细胞培养上清液收集至10 mL无菌离心管，放入4℃冰箱中暂时保存。在培养瓶中添加4 mL的DMEM高糖细胞培养液，继续放置在细胞培养箱中培养；
经过24 h后再次收集上清液于第1天的10 mL无菌离心管中，两次收集的上清液混匀，于离心机上3000 r/min离心10 min，使用10 mL一次性无菌注射器吸取离心后的上清液，注射器去针头，通过0.45 μm滤器过滤除菌，将过滤后的上清液分装于1.5 mL EP管中，于-80℃保存备用。
1.2.4 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的pLVXIRES-Puro-GFP慢病毒转导
将生长状态良好的hESC-MSC、hADSC、hUCMSC细胞用胰酶消化分别以8×103cell/cm2的密度重悬接种于T25细胞培养瓶中，24 h后，-80℃取出冻存的慢病毒上清，取3个15 mL离心管，分别加入1 mL慢病毒上清于离心管内，于离心管内再各加入hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC对应的细胞培养液各4 mL（即三种细胞慢病毒感染过程中慢病毒所用量一致），之后在3个离心管内加入慢病毒转导增强剂Polybrene各4 μL，轻轻混匀，将混合好的感染液分别加入对应的细胞培养瓶中，置于37℃培养箱中培养。48 h以后荧光显微镜下观察各细胞发光情况，每种细胞分别取2×105个细胞流式细胞仪分析各细胞的慢病毒转导效率。细胞培养液中加Puromycin（Puro）筛选细胞，当观察到几乎所有细胞均带有荧光时即停止加Puromycin，将筛选出的GFP+hMSCs增殖传代扩大培养。
1.2.5 GFP基因标记前后hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC增殖检测
将标记GFP基因前后的hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC细胞分别以每孔相同的起始接种数量（1×103个细胞）分别铺至96孔板中，每 24 h加入 Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）于3个重复孔内，2 h后酶标仪检测450 nm处吸光度（D）值，共测5 d，各组设与实验平行不加细胞只加培养液的空白对照孔。结果见图1。
图1 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC标记GFP基因前后增值能力。（a)hESC-MSC和GFP+hESC-MSC增殖曲线对比；
(b)hADSC和GFP+hADSC增殖曲线对比；
(c)hUC-MSC和GFP+hUC-MSC增殖曲线对比Fig.1 Value-added ability before and after labeling GFP gene with hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC.(a)Comparison of proliferation curves between hESC-MSC and GFP+hESCMSC;(b)Comparison of proliferation curves between hADSC and GFP+hADSC;(c)Comparison of proliferation curves between hUC-MSCand GFP+hUC-MSC
1.2.6 GFP基因标记前后hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的诱导分化
成脂分化：12孔板用质量分数0.1%的明胶包被30 min以上，包被成功将明胶吸出，将hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC和其对应的相同 代 数 的 GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSCs分别以每孔1×104cell/cm2的细胞密度接种12孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，37℃，5%CO2培养箱中放置 1 d～3 d，每天更换MSC培养液。细胞融合度达到80%时，弃去原培养液，加入成脂肪细胞分化诱导培 养 基（Adipogenic Differentiation Medium，MADM）。每隔3 d换用新鲜的成脂诱导培养基。诱导分化14 d左右，油红O染色，观察成脂分化结果。
成骨分化：细胞接种方法同成脂分化，当细胞融合度达到80%时，弃去原培养液，加入成骨细胞分化诱导培养基（Osteogenic Differentiation Medium，MODM），每隔3 d换用新鲜的成骨诱导培养基。诱导21 d左右，茜素红染色，观察分化结果。
成软骨分化：分别吸取 5 μL细胞浓度为1×107cell/mL 的 hMSCs、GFP+hMSCs细胞悬液于96孔板的孔中央，置于细胞培养箱中孵育 2 h后加入 100 μL的成软骨分化培养基（Chondrogenic Differentiation Medium，MCDM）。分化14 d后，阿利新蓝染色法染色，观察成软骨分化结果。
1.2.7 流式细胞仪检测GFP基因标记前后hESCMSC、hADSC、hUC-MSC的表面抗原表达
分 别 取 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC、GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUCMSC细胞悬液，离心后用染色缓冲液重悬，加入相应抗体各1 μL 30 min后中和洗涤1～2次进行流式细胞仪分析。检测细胞抗原标记为CD73-APC、CD90-PE/Cy7、CD105-Percp、（CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR）-PE。
1.2.8 统计学分析
利用SPSS软件对实验数据进行分析，组间比较采用独立样本 t检 验；
*P＜0.05为显著，**P＜0.01为极显著。
与hUC-MSC和hESC-MSC相似，hADSC在倒置显微镜下呈单层纤维样细胞贴壁。流式细胞仪检测hADSC表面抗原的结果为阳性高表 达 CD73、CD90、CD105，阴 性 表 达 CD34、CD11b、CD19、CD45和 HLA-DR。经相应定向诱导分化培养基体外培养，可观察到向成脂，成骨和成软骨细胞分化的现象，符合间充质干细胞的基本要求［1］。
2.1 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC经慢病毒转导后GFP的表达及转导效率
hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC经慢病毒感染48 h后，明场光线下可见三者均呈纤维状单层贴壁，细胞胞质丰富，保持了正常良好的细胞形态（图2）；
倒置荧光显微镜下可见标记GFP基因成功的hESC-MSC、hADSC和hUCMSC细胞受蓝色光激发产生的绿色荧光（图2），且三者GFP阳性细胞的数量存在差异。
图2 等量pLVX-IRES-Puro-GFP转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 48 h后细胞形态及GFP表达Fig.2 Cell morphology and GFP expression after hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC transduced with the same amount of pLVXIRES-Puro-GFP lentivirus for 48 h
用等量的pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒分别转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC细胞，它们的转导效率分别为（18.3±0.1）%，（4.5±0.3）%，（12.0±0.2）%。hESC-MSC的转导效率显著高于hADSC（为hADSC细胞的4.06倍，P＜0.01）和hUC-MSC（为hUC-MSC的1.52倍，P＜0.01）。
2.2 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC标记 GFP基因前后增殖能力比较
hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 标记 GFP基因前后的生长曲线显示如图1：hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC与其对应的转导后相同代数GFP+hMSCs的生长曲线相近，且每24 h在450 nm波长下测得的D值均无显著差异（P＞0.05），hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 细 胞 被 标 记GFP基因后增殖力无明显改变。
2.3 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC标记 GFP基因前后体外诱导分化情况
GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSC成脂诱导分化14 d后显微镜下均可见形成胞浆内脂质滴，荧光显微镜下仍可见细胞发绿色荧光，油红O染色鉴定呈红色（图3）。21 d成骨诱导分化后GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSC细胞间形成骨结节，荧光显微镜下可见细胞发绿色荧光，茜素红染色呈阳性（图3）。诱导成软骨分化14 d后GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUCMSC形成成软骨团块，荧光显微镜下可见团块发绿色荧光，阿利新蓝染色呈深蓝色（图3）。染色显示它们的三系分化（成脂、成骨、成软骨）与转导前的结果均一致（图3）。
图3 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC细胞标记GFP基因前后体外成脂、成骨、成软骨分化染色，油红O染色为红色或粉红色即为脂肪粒，茜素红染色为橙红色即为成骨细胞，阿利辛蓝染色为蓝绿色即为软骨细胞Fig.3 Differentiation staining of adipogenesis,osteogenesis and chondrogenesis in vitro before and after labeling GFP gene in hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC cells,oil red O staining is red or pink for fat particles,osteoblasts are stained orange-red with alizarin red,the chondrocytes stained with Alcian blue stain Kit are blue-green
2.4 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 标记GFP基因前后细胞相关表面抗原表达
hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 和 GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSC细胞表面抗原CD73、CD90、CD105阳性比例均在95% 以上，CD34、CD11b、CD19、CD45和 HLADR几乎不表达（＜0.2%，图4）。
图4 流式细胞术分析hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC标记GFP基因前后细胞表面抗原表达Negative表示抗原CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DRFig.4 Analysis of cell surface antigen expression before and after labeling GFP gene with hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC by flow cytometry Negative means antigens CD34,CD11b,CD19,CD45 and HLA-DR
目前干细胞标记方法很多，其中绿色荧光蛋白基因标记较为常见，但大多对动物来源的MSC进行标记研究，对人源MSC的标记研究较少，且关于人源MSC标记GFP基因后的生物学特性是否受到影响，更是鲜有报道且特性分析不全面［22，24］。本研究对不同来源的MSC包括hESC-MSC，hADSC和hUC-MSC进行了GFP基因标记，并分析比较了它们标记前后的生物学特性差异，包括增殖力，成脂成骨成软骨分化潜力和细胞表型的测定。Yu等［25］对人胎盘间充质干细胞（hPMSCs）标记GFP基因，并对其进行了特性分析，结果表明GFP+hPMSCs表型不变，仍具有成脂、成骨和肝分化潜能，本研究结果同样得出GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC和GFP+hUC-MSC与相应的未标记GFP基因的MSC比较细胞表型不发生改变，仍具有成脂、成骨分化潜能，且新发现三者MSCs标记GFP基因后细胞形态及增殖力均无明显改变并仍具备成软骨分化潜能。
慢病毒转导细胞的效率是标记干细胞的重要环节，但仅有关于单个干细胞慢病毒转导效率的研究［26］，不同来源的间充质干细胞慢病毒转导效率的比较尚未见报道。本研究用等量的pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒分别同时感染人胚胎干细胞衍生的MSC、人脐带MSC和人脂肪MSC，流式细胞仪检测它们的慢病毒转导效率，结果发现hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的慢病毒转导效率存在显著性差异（P＜0.01），这些差异可能与不同来源的hMSC增殖力有关，叶进培等报道hESC-MSC的增值力显著高于hUC-MSC［23］。
综上所述，我们发现用pLVX-IRES-Purop-GFP慢病毒感染 hESC-MSC、hADSC、hUCMSC细胞标记GFP基因后对细胞无明显的细胞毒性，不影响hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的多项分化潜能，且细胞生长增殖状态良好，细胞表型的表达无明显改变；
人胚胎干细胞衍生的MSC慢病毒感染效率显著高于组织来源的人脂肪MSC和人脐带MSC，提示前者可能更适合用以慢病毒感染的示踪标记或者基因修饰。
