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谢莹莹，张悦*，刘雁鸣，赵勇，郑金凤，蒋贇，周颖（1.湖南省药品检验检测研究院，长沙 410001；
2.国家药品监督管理局药用辅料工程技术研究重点实验室，长沙 410001）
乳酸又名2-羟基丙酸，是一种天然存在的重要有机酸，作为消毒防腐剂、pH 调节剂、助溶剂等，可用于肌内注射、静脉注射、皮下注射、口服糖浆、片剂、外用和阴道用制剂[1-2]。乳酸按其旋光性通常可以分为D-乳酸、L-乳酸以及外消旋型DL-乳酸3 种，因人体内只有L-乳酸脱氢酶可分解自身产生或摄入的L-乳酸，如过量摄入D型、DL型乳酸会产生酸中毒等代谢紊乱症状，故医药行业原辅料只用L-乳酸[3-4]。乳酸在发酵过程时，伴随产物乳酸生成的同时还有其他一些有机酸副产物，有机酸的含量是评价发酵工艺的重要指标[5-6]。其中《中国药典》2020年版乳酸品种项下采用化学反应控制枸橼酸、草酸、磷酸或酒石酸项[7]；
日本药典（JP17.0）对挥发性脂肪酸进行了控制[8]。为明确乳酸中可能含有的有机酸类型，参考相关文献[9-10]，建立了HPLC-UV 法测定乳酸中其他有机酸，并采用液质联用确认L-乳酸二聚体的结构，确定该方法可有效排除影响有机酸分离因素的干扰，具有检测限低、重现性好的特点，可以用于乳酸的质量控制，现报道如下。
LC-20A 岛津高效液相色谱仪（日本岛津）；
MS105DU 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。草酸（批号：101097-201702，纯度：100.0%）、柠檬酸（批号：111679-201602，纯度：97.0%）、冰醋酸（批号：190079-202002，纯度：99.9%）对照品（中国食品药品检定研究院）；
酒石酸（批号：20180923）、己二酸（批号：20190407）、磷酸（批号：20200108）对照品（均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；
L-乳酸对照品（批号：LRAC 7354，纯度：93.3%，Sigma-Alorich 公司）；
水为实验室自制超纯水。
2.1 色谱条件
色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm，9 μm）；
流动相：5 mmol·L－1H2SO4；
流速：0.6 mL·min－1；
检测波长：210 nm；
柱温：55℃；
进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 供试品溶液制备 取本品0.25 g，精密称定，置50 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取磷酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸对照品各适量，加流动相溶解，并逐步稀释得到系列标准工作溶液（STD1～STD5）（见表1）。
表1 7 种物质的标准工作溶液(mg·mL－1)Tab 1 Standard working solution of 7 substances (mg·mL－1)
2.3 系统适用性试验
取空白溶液（流动相）、供试品溶液、对照品溶液（STD3），进样测定，记录色谱图，结果显示，空白溶液对样品测定无干扰，各成分之间分离度均能达到药典要求[11]。典型图谱见图1。
图1 对照品溶液（A）、空白溶液（B）和供试品溶液（C）色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of reference solution（A），blank solution（B）and test solution（C）
2.4 线性关系的考察
取“2.2.2”项下的系列标准工作溶液，进样测定，记录色谱图，以质量浓度对相应的峰面积进行回归，结果见表2。
表2 各成分线性关系Tab 2 Linearity of various constituents
2.5 精密度试验
取“2.2.2”项下STD3 标准工作溶液，连续进样6 次，结果磷酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸峰面积RSD分别为0.23%、0.036%、0.14%、0.11%、0.064%、0.13%、0.52%。
2.6 重复性试验
取本品（批号：CD190602C）按“2.2.1”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样测定，计算含量，结果杂质仅检出己二酸，含量为0.22%，RSD为4.7%，L-乳酸含量为64.5%，RSD为0.86%。
2.7 稳定性试验
取“2.6”项下供试品溶液和“2.2.2”项下的STD3 溶液在室温（25℃）放置0、2、4、6、8、12、24 h 后测定，结果各成分峰面积的RSD均小于5%，说明供试品及对照品溶液在24 h 内稳定。
2.8 定量限、检测限
取“2.2.2”项下STD1 溶液适量，逐级稀释，并进样测定，以信噪比S/N＝10 和S/N＝3 时各对照品的量为定量限和检测限，结果除主峰（L-乳酸）外，各杂质磷酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、冰醋酸、己二酸检测限分别为2.7、0.15、2.0、5.2、5.4、7.6 μg·mL－1；
定量限分别为9.1、0.50、6.9、17.6、18.2、25.5 μg·mL－1。
2.9 回收试验
分别称取本品（批号：CD190602C）适量，精密称定，置50 mL 量瓶中，分别依次加入磷酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸对照品各适量，用流动相稀释并定容至刻度，平行制备6 份；
分别精密量取上述溶液各10 µL 进样测定，并计算回收率，结果磷酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸的平均回收率分别为103.1%、102.5%、101.5%、100.5%、99.8%、96.2%、101.1%，RSD分别为1.4%、0.80%、1.1%、0.26%、0.59%、0.23%、0.36%。
2.10 耐用性考察
改变柱温（±5℃）、流速（±0.2 mL·min－1）和不同品牌的液相色谱仪，结果不同品牌的仪器对结果无影响；
柱温和流速会影响各组分间的分离，但各组分间的最低分离度均大于1，能够基本分离，对结果无明显影响，表明该方法耐用性较好。
2.11 样品测定
取33 批乳酸样品各适量，分别按“2.2.1”项下方法制备，再进样测定，计算样品中有机酸含量，结果见表3。
表3 样品中的L-乳酸单体及 6 种有机酸杂质检验结果(%)Tab 3 Test results of L-lactic acid monomer and 6 organic acid impurities (%)
2.12 液质联用确认主峰附近峰的结构
2.12.1 液相色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；
流速：0.3 mL·min－1；
柱温：30℃；
流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱，程序见表4。
表4 梯度洗脱表Tab 4 Gradient elution
2.12.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；
源电压4 kV；
氮气流速：3 L·min－1；
加热气流速：10 L·min－1；
干燥器气流速：10 L·min－1；
接口温度：300℃；
离子传输管温度：250℃；
加热模块温度：400 ℃，负离子模式；
一级质谱扫描范围50～1000；
二级质谱碰撞电压：15 eV。
2.12.3 供试品的制备 单独收集图1中供试品溶液的峰8 组分，作为供试品溶液。
2.12.4L-乳酸对照品溶液 取L-乳酸对照品10 mg，加水溶解并稀释成1 μg·mL－1的溶液，即得。
2.12.5 碎片离子确认 精密量取供试品溶液、L-乳酸对照品溶液各3 μL，注入液质联用色谱仪，记录质谱图。结果显示，峰8 母离子一级质谱图中出现了m/z161.15，推测峰8 可能为两个乳酸分子聚合，脱去一分子水，生成乳酸二聚体，分子量为162，在负离子模式下[M-H]－为161。峰8 母离子经碰撞室碰撞后生成了m/z89.45 的碎片离子，即为L-乳酸的碎片离子，证实峰8 为乳酸二聚体。
3.1 检测器的选择
有文献[12]提出有机酸的检测可采用示差检测器，故课题组对该文献方法进行优化，使各成分分离能基本达到《中国药典》2020年版四部通则0512分离度的要求后，采用同一混合标准溶液在示差检测器和紫外检测器上进行测定，结果7 个成分在示差检测器上的检测限明显高于紫外检测器，且示差检测器影响因素多，所以选择紫外检测器进行检测。
3.2 检测波长的选择
对6 种有机酸杂质及L-乳酸的标准溶液进行波长全扫描，发现各成分在210 nm 附近均有最大吸收，所以选取210 nm 作为检测波长。
3.3 结论
该方法不仅可检测出乳酸中6 种有机酸杂质，还可将L-乳酸单体及L-乳酸二聚体区分开来，而《中国药典》2020年版乳酸品种项下[7]的含量测定采用滴定法，其原理是用过量氢氧化钠将乳酸中聚合体水解成乳酸单体后，再用硫酸滴定液返滴定，测定的是样品中乳酸及其聚合体的总和，不能反映样品中乳酸单体的含量；
乳酸在高浓度下会发生聚合反应，生成乳酸聚合体[13]，与现行标准对乳酸的定义相吻合，因此该方法测定L-乳酸单体含量相比于滴定法专属性更强。
本研究建立了一种可有效检测乳酸中L-乳酸单体及6 种有机酸杂质的高效液相色谱法，该方法简便、准确，可有效分离各有机酸杂质并应用于乳酸中L-乳酸单体的批量检测，为乳酸标准的科学性和质量可控性提供参考。
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