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董立学 解绶启 周 亮 陆 星 田 娟 喻丽娟 文 华肖江蓉 蒋 明
(1.中国水产科学研究院长江水产研究所, 武汉 430073; 2.中国科学院水生生物研究所, 武汉 430064;3.武昌首义学院, 武汉 430064)
水产养殖为我国居民提供了优质的动物性蛋白, 满足了食品多样化的需求但离膳食指南推荐差距较大[1]。联合国粮农组织FAO计算出, 17%的动物源蛋白来自水产养殖, 预计到2025年需要增加水产饲料3.7×107kg, 到2030年水产养殖产量达1×108kg[2,3]。随着国家“大食物观”向江河湖海要食物战略的提出, 且水产养殖每生产1 kg干物质消耗的饲料仅为畜禽蛋奶类的1/2—1/5, 发展水产养殖可在增加水产动物性蛋白供给的同时, 降低粮食资源的消耗[4]。我国非粮蛋白质饲料资源丰富, 种类繁多, 包括动物性蛋白源、植物性蛋白源、藻类及其加工产品、微生物蛋白资源、糟渣类产品及其副产品等[5]。加快饲料粮替代原料营养价值评价与应用, 可降低水产饲料对粮食类饲料资源的需求。
草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国产量最大的淡水养殖品种, 年产量达到5.5×109kg[6]。豆粕是草鱼饲料中的一种主要蛋白饲料原料, 然而近年来, 豆粕价格上涨幅度较大, 且主要依赖进口, 因此亟须开展替代豆粕的新型蛋白资源的开发和利用。乙醇梭菌蛋白是发酵制备乙醇过程中生产的一种绿色环保的单细胞蛋白源[7]。黄粉虫作为一种优质的昆虫蛋白源, 富含蛋白质和亚油酸, 在动物饲料中的应用历史悠久[8]。小球藻属普生性单细胞绿藻, 其生长速度快、蛋白质含量高, 在食品和饲料等方面具有广泛的应用[9]。棉籽浓缩蛋白经脱酚去除了棉酚等有害物质, 在水产饲料中可替代或与鱼粉、豆粕搭配使用[10]。已有研究表明, 乙醇梭菌蛋白、黄粉虫、棉籽浓缩蛋白和小球藻等可作为水产饲料蛋白源, 并具有一定的应用潜力[11—14]。
养殖密度是影响鱼类生长、摄食和饲料利用效率的重要因素。养殖密度过低, 会导致饲料利用率和生产效益降低; 养殖密度过高, 鱼类竞争饲料和空间, 产生应激等方面的胁迫, 导致鱼类生长缓慢甚至死亡[15]。有研究表明, 养殖密度和饲料蛋白质水平对鱼类的生长性能具有一定的影响[16,17]。草鱼是典型的草食性鱼类, 也是良好的鱼类营养与饲料研究对象。因此, 本试验以草鱼为研究对象,分别以豆粕、乙醇梭菌蛋白、黄粉虫、棉籽浓缩蛋白和小球藻为单一蛋白源配制五种试验饲料, 研究在0.11、0.16和0.21 kg/m3三种养殖密度下对草鱼生长性能、体成分和血清生化指标的影响, 旨在为豆粕、乙醇梭菌蛋白、黄粉虫、棉籽浓缩蛋白和小球藻在水产饲料中的合理应用提供理论依据。
1.1 试验饲料的设计与配制
分别以豆粕、乙醇梭菌蛋白、黄粉虫、棉籽浓缩蛋白和小球藻为单一蛋白源, 玉米淀粉和木薯淀粉为糖源, 鱼油和豆油为脂肪源, 配制5种等氮等能饲料。试验饲料的配方和基本营养成分及必需氨基酸见表1。饲料原料经粉碎通过60目的试验筛, 按表1配比混合均匀, 少量的组分采用逐级扩大法混合, 加鱼油、豆油和水后混匀, 用膨化机制成直径1.0 mm的膨化颗粒饲料。试验饲料由中国农业科学院饲料研究所饲料创新团队制作。试验饲料的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分及氨基酸分别按照GB/T 6435-2006、GB/T 6435-2006、GB/T 6435-2006、GB/T 6435-2006及GB/T 18246-2019的方法测定。
表1 试验饲料组成及营养成分Tab.1 Composition and nutritional composition of experimental feed (%)
1.2 试验鱼与饲养管理
试验用草鱼购买自洪湖市一草鱼苗种养殖户,试验地点为长江水产研究所山坡养殖实验基地(武汉市江夏区山坡乡和尚桥村)。试验鱼运回后, 先放入池塘网箱中暂养4周, 使草鱼恢复体质适应池塘养殖环境。采用双因素实验设计, 2个因素分别为饲料蛋白源和养殖密度, 其中饲料蛋白源为豆粕、乙醇梭菌蛋白、黄粉虫、棉籽浓缩蛋白和小球藻, 初始养殖密度为0.11、0.16和 0.21 kg/m3(对应为20、30和40尾/网箱), 共15个试验组, 每组设3个重复。正式试验开始前, 将草鱼饥饿24h, 选取1350尾[初始体质量为(5.36±0.18) g]规格均一、体表健康的草鱼, 随机分配到45个试验网箱(1.0 m×1.0 m×1.5 m)。每个网箱中设一圆形悬浮框, 下挂圆形网盘, 饲料投至浮框内, 每天(8: 00和17: 00)投喂两次, 投喂量为鱼体总质量的3%, 持续60d。记录每天试验鱼摄食及死亡情况, 每20天称体质量一次, 根据体质量变化调整投喂量。
养殖期间, 每个网箱用1个曝气头进行连续曝气。水下30 cm的温度为25—30℃, pH 6.5—7.2, 溶氧大于3 mg/L, 氨氮浓度小于0.05 mg/L。该池塘水面面积约为7000 m2, 水深3 m, 池塘中间设3 kW叶轮式增氧机一台, 试验期间, 晴天中午1点和凌晨4点, 各开机2h。阴雨天气, 定时检测溶氧, 当溶氧低于3 mg/L时, 开机增氧。
1.3 样品采集
在养殖试验结束时, 所有试验鱼饥饿24h。然后称量每个网箱中试验鱼的最终体质量并计数存活的个体数。每个养殖箱中, 随机挑选3尾草鱼测量其体长和体质量, 然后置于–20℃冰箱中保存, 测定全鱼的基本营养成分。每个网箱中另取3尾鱼用75 mg/L MS 222麻醉, 尾静脉采血样4 mL, 常温下保存2h后离心10min(960g, eppendorf 5417R)分离血清。随后将此3尾鱼进行解剖, 将内脏(包括肝脏)与肝脏进行分离称重, 计算肝体比(Hepatosomatic index, HSI)与脏体比(Viscerosomatic index,VSI)。草鱼的饲养、处理和取样均按照中国水产科学院长江水产研究所动物福利委员会批准的动物饲养规范进行。
1.4 实验指标测定与计算
用真空冷冻干燥机对全鱼样品进行冷冻干燥(Christ Beta 2-4 LD plus LT; Marin Christ Corporation, 德国), 测定水分。经凯氏定氮自动分析仪(Kjelflex K-360; BUCHI Labortechnik AG, 瑞士)测定粗蛋白(GB/T 5009.5-2016); 采用索氏提取法(GB/T 5009.6-2016)测定粗脂肪; 采用550℃马弗炉灼烧法测定灰分(GB/T 5009.4-2016)。血清生物化学参数: 碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血清白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)、总胆固醇(T-CHO)和葡萄糖(GLU)用全自动生化分析仪(BX-3010, SYSMEX, 日本)测定。
根据以下公式, 计算增重率(Weight gain rate,WGR)、 特定生长率(Specific growth rate, SGR)、饲料系数(Feed conversion ratio, FCR)、蛋白质效率(Protein efficiency rate, PER)、成活率(Survival rate,SR)、肥满度(Condition factor, CF)、肝体比(Hepatosomatic index, HSI)和脏体比(Viscerosomatic index, VSI)。
增重率(WGR, %)＝(Wt–W0)/W0×100
特定生长率(SGR, %/d)=[ln(Wt/Nt)–ln(W0/N0)]×100/t
饲料系数(FCR)=F/(Wt–W0)×100
蛋白质效率(PER, %)=(Wt–W0)/F×P
成活率(SR, %)=Nt/N0×100
肥满度(CF, g/cm3)=W/L3×100
肝体比(HSI)=Wh/W×100
脏体比(VSI)=Wv/W×100
式中,N0为初始鱼尾数,Nt为终末鱼尾数;W0为初始鱼平均体质量(g),Wt为终末鱼平均体质量(g);W为每尾鱼个体质量(g);t为养殖时间(d);F为饲料摄入总质量(g);P为饲料中粗蛋白质含量(%),Wh为肝脏质量(g),Wv为内脏质量(g),L为体长(cm)。
1.5 数据分析
采用SPSS 19.0进行统计分析(SPSS, Chicago IL USA)。数据以3次重复的平均值±标准差(mean±SD,n=3)表示。采用双因素方差分析(Two-way ANOVA), 当差异显著时(P<0.05)采用 Tukey检验进行多重比较, 当两个因素有交互作用时, 则固定一个因素, 对另一个因素进行Tukey多重比较。
2.1 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼生长性能的影响
如表2所示, 草鱼成活率为85.00%—92.50%,各组之间无显著差异(P>0.05)。随着养殖密度的增加, 饲料系数(FCR)呈增加趋势, 特定生长率(SGR)、增重率(WGR)和蛋白质效率(PER)呈降低趋势。在3种养殖密度下, 黄粉虫组FCR均显著高于其他蛋白源组(P<0.05), FBW、SGR、WGR和PER均显著低于其他蛋白源组(P<0.05)。当养殖密度为0.11 kg/m3时, 乙醇梭菌蛋白组SGR和WGR最高, 棉籽浓缩蛋白组PER最高; 当养殖密度为0.16 kg/m3时, 乙醇梭菌蛋白组SGR和WGR最高, 豆粕组PER最高; 当养殖密度为0.21 kg/m3, 黄粉虫组SGR和PER均最低,WGR显著低于其他试验组(P<0.05)。不考虑养殖密度, 黄粉虫组FCR最高, SGR、WGR和PER效率均为最低, 而其他四组蛋白源之间差异不显著(P>0.05)。不考虑蛋白源, 0.21 kg/m3密度组FCR最高,SGR、WGR和PER均为最低; 0.11 kg/m3密度组WGR显著高于其他密度组(P<0.05)。饲料蛋白源和养殖密度对草鱼WGR的交互作用显著(P<0.05)。
表2 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼生长性能的影响Tab.2 Effects of different dietary protein source and stocking density on growth performance of grass carp (mean±SD, n=3)
饲料蛋白源对草鱼的肝体比(HSI)和脏体比(VSI)无显著影响(P>0.05), 黄粉虫组草鱼末体质量(FBW)低于其他蛋白源组; 黄粉虫组草鱼肥满度(CF)与棉籽浓缩蛋白组无显著差异(P>0.05), 均显著低于豆粕组、乙醇梭菌蛋白组和小球藻组(P<0.05)。养殖密度对草鱼的VSI和CF无显著影响(P>0.05),0.21 kg/m3组草鱼FBW和HSI显著低于其他密度组,0.11 kg/m3草鱼HSI显著高于其他密度组(P<0.05)。饲料蛋白源和养殖密度对草鱼HSI的交互作用显著(P<0.05)。养殖密度为0.21 kg/m3时, 黄粉虫组草鱼FBW和HSI最低; 养殖密度为0.16 kg/m3时, 棉籽浓缩蛋白组草鱼CF最低。
2.2 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼体成分的影响
如表3所示, 饲料蛋白源对草鱼全鱼水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量无显著影响(P>0.05)。养殖密度对草鱼全鱼水分、粗蛋白和灰分含量无显著影响(P>0.05), 而0.21 kg/m3组粗脂肪含量显著低于0.11和0.16 kg/m3组(P<0.05)。养殖密度为0.16 kg/m3时, 乙醇梭菌蛋白组灰分含量最高, 黄粉虫组灰分含量最低, 乙醇梭菌蛋白组粗脂肪含量最高; 养殖密度为0.11 kg/m3时, 黄粉虫组粗蛋白含量最低; 养殖密度为0.21 kg/m3时, 黄粉虫组粗脂肪最低, 豆粕组粗蛋白含量最高。饲料蛋白源和养殖密度对草鱼全鱼水分、粗蛋白和粗脂肪含量交互作用不显著(P>0.05), 对灰分含量交互作用显著(P<0.05)。
表3 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼基本营养成分的影响Tab.3 Effects of different dietary protein source and stocking density on basic nutrients of grass carp (%, mean±SD, n=3)
2.3 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼血清生化指标的影响
如表4所示, 经过8周的生长试验, 饲料蛋白源对草鱼血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCHO)和葡萄糖(GLU)的水平无显著影响(P>0.05),小球藻组血清白蛋白(ALB)的水平显著高于乙醇梭菌蛋白组、黄粉虫组和棉籽浓缩蛋白组(P<0.05);黄粉虫组碱性磷酸酶(ALP)的水平显著高于乙醇梭菌蛋白组(P<0.05), 与豆粕组、乙醇梭菌蛋白组和小球藻组无显著差异(P>0.05)。养殖密度为对草鱼血清中TP、ALB、ALP、TG、T-CHO和GLU的水平无显著影响(P>0.05), 0.21 kg/m3组AST、ALT和GLU水平显著高于其他两组(P<0.05), 0.11 kg/m3组ALT的水平显著低于其它两组(P<0.05)。随着养殖密度的增加, 黄粉虫组草鱼血清AST、ALT和TG的水平呈增加趋势, 而TP、ALP和T-CHO的水平呈降低趋势; 豆粕组TP、ALB、AST、ALT和ALP的水平均呈增加趋势; 乙醇梭菌蛋白组、棉籽浓缩蛋白组和小球藻组AST的水平均呈增加趋势。饲料蛋白源和养殖密度对草鱼血清中ALT、ALP、TG、T-CHO和GLU水平的交互作用显著(P<0.05)。
表4 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼血清生化指标的影响Tab.4 Effects of different dietary protein source and stocking density on serum biochemical indexes of grass carp (mean±SD, n=3)
3.1 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼生长性能的影响
养殖鱼类的特定生长率和增重率是评价其生长性能的重要指标[16]。有研究指出, 鱼类养殖密度存在一定的阈值, 当养殖密度超过阈值时, 鱼类的生长性能开始下降[18]。在团头鲂(Megalobrama ambylcephala)[19]、红罗非鱼(Oreochromis mossambicus×O.niloticus)[20]、中华鲟幼鱼(Acipenser sinensis)[21]、黄鳝(Monopterus albus)[22]等的研究中发现鱼类生长性能随着养殖密度增加而下降。在本研究中, 不考虑饲料蛋白源, 高密度组(0.21 kg/m3)草鱼的特定生长率、增重率和肝体比显著低于低密度组(0.11 kg/m3)和中密度组(0.16 kg/m3), 在高养殖密度条件下, 草鱼的生长受到了抑制, 可能是因为草鱼摄食与活动空间受到了限制, 密度造成的拥挤胁迫影响了鱼体的生长[23]。肝体比、脏体比和肥满度可以反映鱼类对饲料中营养物质的吸收状态, 营养素和能量摄入的增加通常会导致鱼类肝体比的上升, 养殖密度与鱼体肝体比呈负相关[24]。随着养殖密度的增加, 鱼体脂肪可能被消耗以供能,导致肝脏中脂肪蓄积量下降, 肝体比降低。
饲料中必需氨基酸的组成平衡性越好, 鱼类对蛋白质的利用效率越高[25]。本研究中, 5种蛋白源饲料氨基酸组成具有一定的差异, 精氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸含量普遍较低, 且含有抗营养因子, 这可能是导致试验组草增重率普遍不高的原因。将蛋白源组与组之间进行比较, 黄粉虫组草鱼生长性能最差, 蛋白质效率最低。除去氨基酸组成不平衡之外, 黄粉虫适口性差也是导致生长缓慢的原因之一。研究表明, 黄粉虫替代鱼粉比例超过60%会导致黑雕幼鱼(Acanthopagrus schlegelii)摄食量下降[26];除黄粉虫组外, 其他蛋白源组生长性能较为接近,乙醇梭菌蛋白组特定生长率和增重率最高, 棉籽浓缩蛋白组蛋白质效率最高, 小球藻组鱼体肥满度最高。这表明乙醇梭菌蛋白、棉籽浓缩蛋白和小球藻作为单一蛋白源在草鱼饲料中与豆粕具有相近的饲料价值。
在本研究中, 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼的增重率存在显著的交互作用。除小球藻外, 各蛋白源组密度为0.11 kg/m3的草鱼生长性能均优于密度为0.21 kg/m3的, 说明降低养殖密度, 在一定程度上能够提高草鱼对豆粕、乙醇梭菌蛋白、黄粉虫和棉籽浓缩蛋白的利用效率。Timalsina等[17]研究发现养殖密度和饲料蛋白源组成对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的增重率和特定生长率无显著影响, 这与本研究的结果不同, 可能是由于该研究中的养殖密度并未达到对鱼类的生长产生不利影响的程度。
3.2 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼体成分的影响
营养成分是评价养殖鱼类肌肉品质的重要指标, 其往往受到养殖环境和饲料种类等因素的影响[28]。鱼类对营养物质吸收利用能力不同, 饲料组分的差异可能会导致鱼体蛋白质和脂肪含量产生变化[29]。研究表明, 在饲料中使用乙醇梭菌蛋白替代豆粕或棉籽蛋白替代鱼粉, 对草鱼全鱼粗灰分、粗蛋白质和粗脂肪含量无显著影响[30,31]。本研究与以上结果相似, 以豆粕、乙醇梭菌蛋白、黄粉虫、棉籽浓缩蛋白和小球藻为蛋白源, 对草鱼全鱼水分、粗蛋白质和粗脂肪含量未产生影响; 当养殖密度升高到0.21 kg/m3时, 草鱼粗脂肪含量显著下降。密度是一种重要的环境因子, 高密度的养殖模式下鱼类会出现拥挤胁迫, 导致能量消耗增加, 不利于营养物质的积累[32]。随着养殖密度的增加, 养殖鱼类个体间竞争加剧, 易引起应激反应, 导致运动耗能增加[33]。脂肪作为生物体内储能和供能的重要物质, 在高养殖密度下, 鱼类会通过甘油三酯的分解给机体供能[34],这可能是导致鱼体粗脂肪含量下降的原因。
本研究中发现, 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼全鱼粗蛋白和粗脂肪含量不存在显著的交互作用,类似的结果在黄金鳊(Notemigonus crysoleucas)[35]和虹鳟[17]等养殖密度和饲料蛋白质水平的研究中也有发现。
3.3 饲料蛋白源和养殖密度对草鱼血清生化指标的影响
高密度养殖环境造成的拥挤胁迫会引起鱼体的应激反应, 导致血清生化指标发生变化[36]。谷草转氨酶和谷丙转氨酶是反映肝脏功能的重要生理代谢酶, 参与机体氨基酸和乳酸的代谢, 其主要存在于肝细胞内, 当肝细胞受损时, 转氨酶便会释放到血液里, 使血清中转氨酶活性升高。葡萄糖是机体生命活动的主要能量来源, 在一定范围内, 血糖的升高能增强机体抗逆能力, 提高免疫力[37]。在本研究中, 随着养殖密度的增加, 草鱼血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶和葡萄糖的水平增加，这与团头鲂[38]、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[39]和大口黑鲈(Micropterus salmoides)[40]等养殖密度的研究结果相似。研究结果表明, 养殖密度的增加, 可能导致草鱼肝脏器官受到损害, 因此血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的水平升高。同时, 应激状态下的机体能耗增加, 促进了糖原分解来满足能量的需求,导致血清葡萄糖含量升高[41]。
血清白蛋白主要在肝脏中合成, 具有维持血浆胶体渗透压和运输代谢产物的功能; 碱性磷酸酶是一种重要的非特异性免疫酶, 机体肝脏受到损伤时其活性升高[42]。在本研究中, 小球藻组血清白蛋白的水平最高, 乙醇梭菌蛋白组碱性磷酸酶的水平最低, 而黄粉虫组草鱼血清白蛋白的水平最低而碱性磷酸酶的水平最高。有研究表明, 随着饲料中黄粉虫比例的增加, 罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)血清碱性磷酸酶的水平增加[43]。这可能是因为黄粉虫组草鱼肝脏受到损伤, 使得碱性磷酸酶水平升高, 同时肝脏功能异常导致蛋白合成能力下降,因此血清白蛋白水平降低。血糖和血脂是反映机体能量代谢的重要指标[16]。在本研究中, 与中密度(0.16 kg/m3)相比, 高密度(0.21 kg/m3)下黄粉虫组和小球藻组草鱼血清甘油三酯水平升高, 乙醇梭菌蛋白组和小球藻组血清葡萄糖水平升高, 这表明高密度胁迫可能导致了鱼类脂肪和葡萄糖代谢增加, 以满足机体对能量的需求。
综上所述, 在本试验条件下, 养殖草鱼幼鱼(5.36±0.18) g的密度达到0.21 kg/m3时, 饲料效率显著降低, 血清生化指标发生变化, 生长受到抑制。乙醇梭菌蛋白、棉籽浓缩蛋白和小球藻作为单一蛋白源在草鱼饲料中与的豆粕具有相近的饲料价值。以蛋白质效率和增重率为评价指标, 草鱼对5种蛋白源的利用能力为乙醇梭菌蛋白=小球藻=棉籽浓缩蛋白=豆粕>黄粉虫。
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