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季美泉 丁 涛 赵 滦 费晓庆* 吉 挺 王心怡 陈 磊 林 宏 胡国绅 李贤良韩 芳 闫景升
（1.南京海关动植物与食品检测中心，南京 210019; 2.扬州大学 动物科学与技术学院，扬州 225000; 3.东南大学成贤学院，南京 210088;4.重庆海关技术中心，重庆 400020; 5.合肥海关技术中心,合肥 230000; 6.江苏经贸职业技术学院，南京 200002）
蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1]。枇杷花蜜作为中蜂蜂蜜的重要冬季蜜源，花蜜充足且花期长。枇杷蜂蜜就是由蜜蜂采集枇杷花蜜酿造而成。依据蜂蜜的采集和酿造时间，可分为未成熟蜂蜜与成熟蜂蜜。中华蜜蜂采集酿造出的成熟枇杷蜜具有更优的品质[2]；
其具有浓郁的苦杏仁芬芳，优越的口感，优良的抗菌性，润肺止咳、调节胃肠道功能、增强免疫力等较好的保健作用[3]。而利用未成熟蜂蜜制造假成熟蜜获得更高收益的行为，在近些年变得最为常见。为了使未成熟蜂蜜中的水分、总糖含量等基本指标达标，对蜂蜜进行高温加热脱水处理但是加热过程破坏了蜂蜜中的活性物质，产生了美拉德反应产物的同时，严重影响蜂蜜的营养价值[4]。蜂蜜的酿造过程是复杂的生物转化过程，目前已有对蜂蜜成熟过程中水分、酸度、糖类含量及酶值等物质变化规律的研究[5-10]。稳定碳同位素比值在蜂蜜的真假鉴别上运用的比较成熟[11-13]，但尚未有对蜂蜜成熟过程中稳定碳同位素比值变化的相关研究。
本研究拟建立EA-IRMS 法研究枇杷蜂蜜成熟过程中稳定碳同位素比值变化规律，为枇杷蜂蜜成熟过程的研究提供技术支撑，为枇杷蜂蜜的品质评价提供数据参考。
2.1 实验材料
2021年12月，在江苏省苏州市吴中区西山枇杷园区，正值枇杷盛花期，中华蜜蜂负责枇杷蜜的采集工作。选择枇杷园内的蜂场作为采样点，随机选取5群蜂群群势比较接近的中华蜜蜂作为取样对象，每个蜂箱内有5张巢脾；
样品采集前清空巢脾。每一张巢脾都取出进行标记（标记是否有进蜜），直至整张巢脾都储满蜂蜜。每天按照标记的巢房进行取样，用5mL的一次性吸管吸取。5个蜂箱编号A~E，每天1个蜂箱取1次，共计18天 90 个枇杷蜜样品，样品采集情况见表1，其中12月27日起巢蜜已经封盖。枇杷花蜜样品直接吸取于处于盛花期的枇杷花，共计6个枇杷花蜜样品。2021年成熟枇杷蜜样品2个，采于枇杷园内的蜂场。枇杷蜂蜜和枇杷花蜜样品于4 ℃贮存直至分析。
天气温度记录方式：天气情况在每日取样前进行记录，记录的是当天的外部环境温度，情况见表1。
表1 成熟过程中枇杷蜂蜜样品信息
2.2 仪器与试剂
元素分析仪与稳定同位素质谱仪 (Thermo公司，稳定同位素质谱仪型号DELTA PLUS)，用于测定蜂蜜和花蜜的δ13C值；
纯水仪（ Milli-Q， Millipore 公司），提供超纯水用来溶解蜂蜜。
标准物质：
Beet Sugar（IA-R005，δ13C值为-26.03‰，Sercon）；
锡杯：5×3.5 mm（Element microanalysis公司）。
2.3 实验方法
2.3.1 样品前处理条件
EA-IRMS测定的样品前处理：称取约2g样品于50mL 离心管中，加20 mL蒸馏水溶解，5000r/min离心5 min后取上清液1mL于1.5mL 离心管中，待测。
2.3.2 元素分析-同位素质谱仪条件
元素分析仪的氧化管温度为950 ℃，还原管温度为680℃，气相色谱柱炉温为50 ℃，氦气流速为120 mL /min，吹扫气流速为120 mL /min，氧气流速为250 mL /min。每个样品平行测定两次。进行样品测试时，每个样品的分析起始阶段通入CO2参考气。
δ13C值的计算是基于国际标准物质Vienna peedee belemnite standard (VPDB)， 计算公式为：
这里R为同位素比率13C/12C，RVPDB= 0.0112372。
参考气使用前，用已知δ13C值的标准物质Beet Sugar对CO2参考气进行反标定，要求所测定的δ13C值与证书标示值相差小于0.30‰。基于标准物质比较稀有，样品分析时采用质控样来对仪器分析准确性评价。本实验选取蜜二糖（melibiose）作为分析测定的质控样，其标定结果为−25.08‰。
3.1 前处理条件的优化
GB/T 18932.1−2002中对于蜂蜜样品采用过尼龙滤布过滤的方式去除蜂蜜中固体杂质，后用移液器吸取3 μL 蜂蜜于锡杯中。枇杷蜂蜜采样时，按照标记的巢房进行取样，用5mL的一次性吸管吸取多个标记的蜂房，取满20mL。而蜜蜂在酿蜜过程中是把花蜜摊薄在蜂巢壁上（这样可以增加蒸发面积，水分蒸发快，能够降低蜂蜜的水分），这期间也许会将蜂蜜在不同的巢房之间重新分配[14]。为了使测定更准确、更有代表性，本研究采取纯水溶解的方式。同时，由于枇杷蜂蜜中的蛋白质和花粉，会对蜂蜜的碳同位素比值（δ13CH值）产生影响[3]，本研究通过5000r/min离心5 min可去除花粉等杂质，取上清液减少干扰，测定时用移液器吸取0.6 μL于锡杯中，密封备用。
3.2 EA-IRMS对枇杷蜂蜜的检测
首先采用EA-IRMS法对90个枇杷蜂蜜样品测定，记录的碳同位素比值δ13CA、δ13CB、δ13CC、δ13CD、δ13CE，并计算每天的δ13C均值δ13Caverage，数据汇总见表2；
用EA-IRMS法对6个枇杷花蜜样品测定，δ13C值分别为：−27.51‰、−27.43‰、−27.37‰、−27.56‰、−27.49‰、−27.48‰，均值为，−27.47‰；
用EAIRMS法对2021年东山、西山成熟枇杷蜜样品测定，δ13C值分别为：−25.30‰、−25.33‰。图1为某一枇杷蜂蜜的EA-IRMS色谱图。
表2 EA-IRMS测得枇杷蜂蜜的同位素结果
图1 一个枇杷蜂蜜的EA-IRMS色谱图
3.3 蜂蜜δ13C随酿造天数变化分析
3.3.1 蜂蜜δ13C随酿造天数变化情况
蜂蜜酿造过程是脱除水分、富集与转化营养物质的复杂生物过程。中蜂的外勤蜂通过口器吮吸枇杷花蜜，将其储存到蜜囊中，带入蜂巢，转移给内勤蜂继续酿造[14]。其中枇杷花蜜δ13C值为−27.47‰，当经过中蜂采集、酿造、转移至巢房后δ13C值为−20.21‰至−21.15‰，A~E5个蜂箱1d至18d的δ13C值的极差Δδ13C(max−min）分别为：4.90‰、4.08‰、4.71‰、5.39‰、4.60‰。δ13Caverage随酿造天数变化情况见图2。由图2可知，从1d至10d的δ13C值下降比较快，而10d至18d的δ13C值小幅度波动下降。由此可见，蜂蜜δ13C值变化与酿造有关。
图2 δ13Caverage随酿造天数变化
3.3.2 各蜂箱间蜂蜜δ13C值酿造天数变化情况分析
浙西南山区中蜂蜂蜜封盖时长可有效提高蜂蜜浓度，封盖15d后的蜂蜜含水量显著低于封盖0d的含水量[15]。而华南地区中蜂蜂蜜连续9年研究结果显示表明，华南地区在其特定的地域、气候、蜜源条件下，自然成熟封盖的中蜂原蜜水分含量均超过20%[16]。由此可见中蜂蜜蜂的封盖行为是权衡当时的环境及蜂蜜状态做出的决定。
从表2中看出，A~E 5个蜂箱中δ13C在同一酿造时间的数值并不完全相同，例如A~E蜂箱6d的δ13C值分别为：−23.10‰、−21.22‰、−23.94‰、−21.76‰、−22.09‰，最大差值达到2.72‰ 。这可能是由中华蜜蜂在酿蜜期间将蜂蜜在不同的巢房之间重新分配[14]，使得不同酿造时间的蜂蜜混到一起导致的。
3.3.3 各蜂箱内在蜂蜜封盖后其蜂蜜δ13C情况分析
蜜蜂将采集来的枇杷花蜜利用自身的生物酶酿造，将枇杷花蜜充分酶解转化，把花蜜水分蒸发后分泌蜂蜡，将酿好的蜂蜜封盖，此时一般意义上认为蜂蜜成熟了。然而许政等发现此时的酿造好的蜂蜜在封盖房里在蜂巢蜜并没有完全成熟还存在酿造后熟转化的过程[17]。本次研究采集的枇杷蜜在14d时已封盖，从14d至18d所取的枇杷蜜样品均为封盖蜜样品。通过表2我们知道，枇杷蜜δ13C 的值还在变化，A~E蜂箱14d至18d时间范围内δ13C值的极差值Δδ13C(max−min)1分别为：1.46‰、0.47‰、0.80‰、1.17‰、1.00‰，见表3。而成熟蜜多次测定结果的绝对差值一般不超过0.30‰，由此说明封盖蜜并没有完全成熟，还存在酿造后熟转化的过程。
表3 EA-IRMS测得封盖枇杷蜂蜜的同位素结果
通过研究证明枇杷蜂蜜δ13C值是跟其成熟过程相关的。枇杷蜂蜜δ13C值随着酿造时间的推移，由−20.71‰降低至−25.16‰，最终可能趋于成熟枇杷蜜的−25.30‰左右。封盖时期δ13C值的极差值Δδ13C(max−min)1远大于成熟枇杷蜜多次测定的差值0.30‰，说明封盖蜜并没有完全成熟，还存在酿造后熟转化的过程。本研究为确定枇杷蜂蜜的合理采收期及鉴别成熟枇杷蜜提供了数据支撑。
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