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尚丽娜，熊学艳，蒋益，戴标，王春来，毛旭华
(1.宁夏吴忠市人民医院儿科，宁夏吴忠 751100；
2.银川市妇幼保健院普儿科，银川 750000；
3.江苏大学附属宜兴医院 a.儿科，b.体检中心，c.检验科，江苏无锡 214200)
发育性癫痫性脑病9型(developmental and epileptic encephalopathy-9，DEE9)是一种以认知功能障碍、发育迟缓、精神异常为特征的早发性癫痫症。该疾病与位于Xq22染色体上的原钙黏蛋白19(Protocadherin 19, PCDH19)密切相关，PCDH19基因可以编码钙依赖性细胞黏附蛋白——PCDH19[1]，该蛋白质主要在中枢神经系统中表达，可以调节神经元细胞增殖、细胞黏附、细胞迁移以及突触传递。基因点突变或基因片段缺失、插入、重复等致病变异形式均可能会导致PCDH19基因功能异常。PCDH19基因突变被认为是DEE9的主要诱因。在DEE9患者中，携带PCDH19基因突变的杂合子女性发病，携带此突变的半合子男性不发病，但含有2种不同遗传特征细胞群的嵌合体男性发生PCDH19基因突变时，会出现DEE9疾病症状[2]。本研究拟调查一DEE9家系的基因型，对患儿及其父母外周血进行外显子组高通量测序，确定患儿遗传学病因，以期提高临床医师对DEE9的认识。
1.1研究对象 患儿女性，3岁5个月，主因“半天内抽搐4次”于2021年10月入住银川市妇幼保健院儿科。患儿入院前半天无明显诱因出现抽搐，表现为意识丧失，呼之不应，双眼凝视、口吐白沫，双手握拳，四肢抖动持续10余秒抽搐自行缓解，无大小便失禁，无发热及头痛。追问病史，患儿1岁5月龄有无热惊厥病史，脑电图异常，经口服左乙拉西坦口服液1.5 mL/次，2次/日抗癫痫治疗，服药1年后无发作故而自行停药。出生史无异常，父母体健，否认近亲婚配及家族遗传性疾病。
入院体格检查T：36.8 ℃，P：90次/分，R：20次/分，神志清楚，咽部充血，双侧扁桃体1度肿大。双肺呼吸音清晰，未闻及干湿性啰音。心率90次，心律齐，未闻及病理性杂音。腹部无异常。生理反射存在，病理反射未引出，四肢肌力正常。入院后辅助检查血常规：血细胞计数8.82×109/L，红细胞4.49×1012/L，血红蛋白128 g/L，血小板247×109/L，淋巴细胞百分比20.3%，中性粒细胞百分比74.7%。C-反应蛋白0.29 mg/L，肌钙蛋白6.45 pg/mL。血糖、肝肾功、电解质、血气均正常。脑脊液常规及生化无异常。颅脑核磁示：右侧额叶近中线处及右侧顶枕叶交界处皮层下DWI异常信号影，不除外缺血缺氧后遗改变。监测脑电图：幼儿期异常脑电监测，检测中1次强直-阵挛发作。
入院后给予苯巴比妥钠，咪达唑仑镇静治疗，吸氧甘露醇降颅压，患儿仍有反复抽搐。结合脑电图结果，抗癫痫治疗的左乙拉西坦口服液调整剂量3 mL/次，2次/日，抽搐次数减少。根据患儿临床特征及辅助检查高度怀疑遗传学疾病可能。为进一步明确诊断，经家长同意抽取患儿及父母外周血2 mL进行全外显子基因测序(委托北京迈基诺基因科技股份有限公司检测)。
1.2方法
1.2.1试剂与仪器 Blood Genomic DNA提取试剂盒(加拿大Norgen Biotek公司)，快速高保真DNA聚合酶(北京索莱宝公司)，DNA凝胶回收试剂盒(南京诺唯赞公司)，Sanger测序试剂盒(美国ThermoFisher公司)。NanoDrop One超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，GTC96S梯度PCR基因扩增仪、CSL-RVMSCHOICE一体式核酸电泳仪(英国Cleaver Scientific公司)，ABI 3730XL自动测序仪(美国ABI 公司)，Illumina MiSeq测序系统(美国Illumina公司)。
1.2.2样本收集及DNA抽提 用EDTA-K2抗凝血常规真空管采集患儿及其父母外周血样本2 mL,置于-80 ℃保存。按照Blood Genomic DNA提取试剂盒说明书提取外周血DNA，产物用NanoDrop One超微量紫外分光光度计进行质量及纯度检测，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值为1.7～1.8的DNA样本进行后续试验，样本置于-20 ℃保存备用。
1.2.3全外显子基因检测突变位点 患儿及其父母外周血的全外显子基因检测按照参考文献[3]，由北京迈基诺基因科技股份有限公司完成，该公司利用自主研发的GenCap®全外显子基因捕获技术结合Illumina MiSeq测序系统(美国Illumina公司)对目标区域内的23 000种基因进行检测，序列读数与GRCh37/hg19人类基因组组装比对。为保证数据分析的精确性，利用蛋白质功能预测软件REVEL(Rare Exome Variant Ensemble Learner)[4]对变异位点进行注释解读，按照突变形式、人群频率、遗传方式等指标对数据进行过滤，选择与表型相关的致病位点进行后续研究。
1.2.4Sanger测序验证突变位点 对患儿及其父母基因组运用Sanger测序进一步验证全外显子测序所获得的致病位点，引物序列使用在线软件Primer 6.0设计，并由上海擎科生物科技有限公司合成。序列覆盖PCDH19基因(NC_000023.10)第1号外显子中待验证的致病位点及其侧翼序列(PCDH19F：5′-CAAGGTGACCGACTCCAAT-3′，PCDH19R：5′-CGCCTATCTGCTCTCTGTGT-3′)。使用快速高保真DNA聚合酶对目标区域进行扩增。PCR扩增体系为50 μL，包括：ddH2O 40 μL，10×PCR mix 5 μL，PCDH19F 1 μL，PCDH19R 1 μL，dNTP 1 μL，DNA模板1 μL，高保真酶1 μL。PCR反应参数：95 ℃ 2 min；
95 ℃ 20 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循环35次；
72 ℃ 5 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后用DNA凝胶回收试剂盒纯化，利用Sanger测序试剂盒进行测序反应，使用ABI 3730XL自动测序仪进行测序验证。
2.1先证者及其父母的PCDH19基因突变检测结果 全外显子组测序结果发现，患儿基因PCDH19(NM_001184880)在1号外显子处存在c.851_852dupGC变异，且为杂合型，即在基因CDS序列中，第851和852位置处的核苷酸序列GC发生了重复性插入(图1)。患儿父母未发生该突变。
注：Reference，参考序列；
A，先证者测序结果；
B，先证者父亲测序结果及反向互补序列；
C，先证者母亲测序结果；
红色箭头，GC插入突变。
2.2蛋白质翻译预测结果 运用DNAMAN软件对序列进行蛋白质翻译预测，结果发现上述二核苷酸插入导致该基因编码的蛋白质发生移码突变，破坏了第284位氨基酸后的读码框，使第285位氨基酸由T变为A，且在第305位处获得一终止密码子，从而使该蛋白质翻译提前终止(图2)。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南[5]，该变异初步判定为致病性变异(Pathogenic)：该变异为零效变异(移码突变)，可能导致基因功能丧失(极强致病性证据PVS1)。经家系验证分析，患儿父亲该位点无变异，患儿母亲该位点无变异，此变异为自发突变(强致病性证据PS2)。该突变形式在正常人群频率1 000 genomes(千人基因组)、ESP6500(NHLBI Exome Sequencing Project)、EXAC(The Exome Aggregation Consortium)和 EXAC-EAS(EXAC约 4000东亚人数据)数据库中未见报道(中等致病性证据PM2)。经公共数据库查询，基因PCDH19(OMIM：300460)的突变可导致患者发生X染色体相关的DEE9(OMIM：300088)，该疾病特征与本案例先证者表型相符，但突变类型不一样。Sanger测序验证结果证实，受检者PCDH19基因发生c.851_852dupGC杂合突变，父亲和母亲均未发生突变，突变类型属于从头突变，该家系图谱见图3。
图3 该例DEE9患儿的家系图谱
DEE9又称限于女性的癫痫伴智力低下病症(epilepsy with mental retardation limited to females，EFMR)[6]，是一种严重的神经发育障碍疾病，主要由Xq22染色体上PCDH19基因突变导致其编码的PCDH19蛋白在神经元连接、突触膜信号传递等生物过程中的作用失调而致病[7]。PCDH19主要在海马和大脑皮层的Ⅱ/Ⅲ层和Ⅴ层表达，也会与N-钙黏蛋白相互作用，影响突触可塑性[8]。DEE9的主要临床特征包括：婴幼儿时期发病、局灶性癫痫发作、失张力癫痫发作、智力缺陷、全面发育迟缓、全面性强直-阵挛发作、失神发作、全身性肌阵挛发作、发育倒退，其他临床特征还包括自闭症、精神异常。该病症严重影响患儿的身心健康，同时会给患者家庭带来较大的经济负担。
PCDH19基因有6个外显子，其编码的PCDH19包括信号肽、6个保守钙黏蛋白重复序列组成的细胞外结构域、跨膜区域和细胞内C末端结构域。至今为止至少发现约有160多种PCDH19突变类型，包括碱基缺失或插入、剪切位点突变、无义突变、错义突变等，大多数的突变发生在第1个外显子，以新生突变为主。基因突变形式有c.812G>A(p.Gly271Asp)[9]、c.1508_1509 insT(p.Thr504Hisfs Ter19)[10]等，这些突变形式都可能导致PCDH19功能异常。但不是所有的PCDH19基因突变都会导致DEE9，还可能引起睡眠障碍等疾病[11]。PCDH19基因突变形式与疾病的相关性需要临床医生结合受检者的临床表现、家族史及其他检测结果进行综合分析。Depienne等[12]于2009 年报道了1 例男性DEE9患者存在PCDH19基因缺失的体细胞嵌合突变，患者外周血白细胞中整个PCDH19基因缺失，但在患者部分皮肤成纤维细胞中存在PCDH19等位基因，该发现提示了一种致病机理：PCDH19基因突变需要2个细胞群(突变体和野生型)才能发生疾病，而同质细胞群(无论是突变体还是野生型)都不会导致疾病。PCDH19基因突变与X染色体遗传疾病发育性癫痫性脑病密切相关，临床医师应了解PCDH19基因的不同突变形式，提高对DEE9的认识。
在本研究中，对先证者及其父母进行全外显子组测序，结果表明先证者的PCDH19基因在1号外显子处存在c.851_852dupGC二核苷酸重复插入杂合突变，经数据分析发现，PCDH19基因编码区第851～852位的核苷酸GC发生重复插入，该异常插入使得蛋白质翻译发生移码突变而提前终止于305位氨基酸处。PCDH19基因的第1个外显子编码PCDH19蛋白的细胞外重复序列[13]，该结构主要介导细胞之间的黏附作用及信号传导功能，蛋白质翻译的提前终止严重影响其正常生理功能。Lamers等[14]通过监测DEE9小鼠模型中大脑皮质活动的电生理学表征，发现成年早期缺失PCDH19会导致疾病发作。该患儿出生后就有癫痫反复发作、惊厥、脑电监测异常现象，症状与DEE9相一致。由于PCDH19突变所致的DEE9为X染色体相关的遗传疾病，PCDH19基因突变已被认为是DEE9的主要发病原因[15]，当表达野生型PCDH19的神经元和表达突变型PCDH19的神经元共存，或根本不表达，会破坏同质细胞群之间的黏附作用，扰乱细胞通讯，导致疾病发作[16]。高通量外显子测序及Sanger测序证实本研究的先证者是致病杂合突变型，但患儿的父母未发生突变。先证者的PCDH19基因在1号外显子发生c.851_852dupGC p.T285Afs*21从头突变，是DEE9的一种新型突变方式。
随着DEE9患者的数量不断增加，PCDH19基因的突变形式不断被发现，但对该基因突变导致这种综合征的详细分子机制知之甚少。本次研究中，笔者分析了患者的测序数据，后续可进一步通过分子细胞实验评估该PCDH19突变形式对神经元细胞的影响，进而明确该突变形式的具体致病分子机制。综上所述，本研究扩展了PCDH19关于DEE9疾病的突变形式，为遗传咨询、预后检测和产前诊断提供了有力支持。
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