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康婕，雷兰兰，舒静，张曙东，马倩雯
陕西省产品质量监督检验研究院（西安 710048）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），革兰阳性菌代表，在自然界分布广泛，是一种常见的食源性致病微生物，可引起化脓、乳腺炎、败血症和脑膜炎等疾病，会以各种方式侵害宿主细胞，使病情加重[1-6]。由于金黄色葡萄球菌代谢类型为需氧或兼性厌氧，对环境要求不高，能在各种恶劣环境中存活，并且能在适当条件下产生肠毒素，引起的食物中毒，对人体健康危害较大[7-9]。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，其中不乏国内知名企业，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒约占食源性微生物食物中毒事件的25%，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门菌和副溶血性弧菌的第三大微生物致病菌，不仅对人身体健康造成威胁，也给企业造成经济损失[10-13]。因此加强食品中金黄色葡萄球菌的监管及检测工作任重道远。同时，应提高食品检验检测机构的整体水平，定量质控菌株就是检测机构自检自查自控、省级部门全面考核的重要工具，然而国内外质控样品成本过高，无法满足常态化考核，所以自主研制微生物定量菌株尤为重要。试验以均匀性和稳定性良好的金黄色葡萄球菌定量菌株质控样品的研制为目的，优化设备条件，定制适用耗材，探究菌体制备最佳条件、各个环节致死率、储存条件的验证及均匀性和稳定性的验证，为标准定量菌株的研制提供依据[14-15]。
1.1 供试材料
1.1.1 材料与试剂
金黄色葡萄球菌菌株ATCC 6538（美国模式菌种收集中心）。
脱脂乳（市售脱脂乳、经检验不含目标菌）；
海藻糖；
蔗糖；
大豆蛋白；
等。
TSB培养基；
定值无菌加长具棉巴氏德管（细部15 cm）；
血琼脂平板（购自北京陆桥，货号PB001，批号210602）；
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（北京陆桥，货号CM301，批号191106）。
1.1.2 仪器与设备
MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌器[迪图（上海）生物科技有限公司]；
SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博讯实业医疗设备厂）；
BCD-539WT/WTY/WH型海尔宇航冰箱；
CX41型生物显微镜（日本OLYMPUS）；
BSD-100型振荡培养箱（上海博讯实业医疗设备厂）；
VITEK2 compact型全自动微生物生化鉴定系统；
1300SERIESA2型二级生物安全柜、Epsilon 2-4LSCplus型真空冷冻干燥机（CHRIST德国）；
GL-20G-II型冷冻离心机；
氧气瓶；
火焰封口器；
TDZ5-WS型台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）定制冻干管（内径3 mm、长20 cm玻璃管）；
EP管。
1.2 试验方法
1.2.1 金黄色葡萄球菌生长曲线的测定
将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 6538从30%甘油管中转种至血琼脂平板上放置于生化培养箱，于36℃培养24 h。将血琼脂平板上的培养物转种至50 mL的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），放置于振荡培养箱以200 r/min的转速摇瓶36 ℃连续培养，每隔2 h取菌液进行吸光度的测定，以培养时间为横坐标，600 nm处吸光度为纵坐标，绘制生长曲线，观察对数期结束点作为收获菌体的最佳时间。
1.2.2 冻干保护剂的选择
为避免冻干过程对金黄色葡萄球的损伤，添加适量的保护剂可以提高菌体的存活率，其中棉子糖、蔗糖、乳糖、海藻糖等糖类和胶原蛋白、大豆蛋白、脱脂乳等蛋白质类都是广泛应用的保护剂，抗坏血酸、磷酸盐缓冲液、硫代硫酸钠、羟胺、氨基酸、聚乙二醇、甘油、二甲基亚砜等都可以使菌体在冷冻环境中免受损害，糖类和蛋白质类保护剂可在细胞表面形成黏性层，从而保护细胞[16]。海藻糖能够在冷冻、干燥和贮藏过程中均有稳定细胞膜和蛋白质结构的作用，且玻璃化转变温度高，使冷冻干燥过程的基质保持稳定。蔗糖是一种双糖，研究表明双糖比其他糖类对细胞磷脂有更强的结合力，在干燥过程中能表现出耐受力，还能保护蛋白结构。大豆蛋白作为蛋白类保护剂能在菌体细胞壁外形成保护膜，从而有效地保护菌体。本着保护效果好、成本较低的原则，选择海藻糖、蔗糖和大豆蛋白作为保护剂进行研究。
1.2.3 金黄色葡萄球菌质控样品制备流程
1.2.3.1 制备流程
制备流程如图1所示。
图1 金黄色葡萄球菌制备流程
1.2.3.2 制备要点
1.2.3.2.1 预处理定制冻干管预处理：用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后，加入脱脂棉塞后，在121 ℃下高压灭菌15～20 min，备用。
无菌脱脂牛奶：如果是盒装脱脂牛奶，应进行分装灭菌115 ℃、20 min，或者30 g脱脂奶粉溶于200 mL蒸馏水中，灭菌115 ℃，15 min。
1.2.3.2.2 菌体制备
将1.2.1小节中培养至对数期的新鲜金黄色葡萄球菌菌液（培养物浓度以细胞或孢子不少于107为宜），测定600 nm处的吸光度，吸取10 mL菌液，按10 000 r/min离心5 min，弃上清液得到菌泥，使用PBS清洗后，按10 000 r/min再次离心5 min，得到的菌泥中采用无菌具塞巴氏毛细滴管加入10%无菌脱脂牛奶，在涡旋振荡仪充分混匀，并加入复合保护剂，吸出分装至冻干管（管外壁应提前贴好标签注明菌株信息及保藏时间）。采用无菌具塞巴氏毛细滴管，直接滴入冻干管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量200 μL。分装冻干管时间尽量要短，最好在1～2 h内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。
1.2.3.2.3 预冻
将分装好菌液的西林瓶置于冷冻干燥机下层进行预冻，预冻4 h以上，温度达到-20～-50 ℃左右。
1.2.3.2.4 主干燥
在冷冻干燥机隔板内开始冷冻干燥，时间一般为48 h，至完全干燥成粉末状。
1.2.3.2.5 终末干燥
终末干燥阶段隔板温度回升，结束后得到白色疏松的冻干样品。
终止干燥时间应同时满足几种情况进行判断：西林瓶内冻干物呈酥块状；
松散片状或者真空度接近空载时的最高值；
样品温度与管外温度接近。
1.2.3.2.6 真空封口及真空检验
在真空状态下压盖，并使用高频电火花真空测定仪测定真空度。
1.2.3.2.7 质量检查
冷冻干燥后抽取若干支冻干管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
1.2.3.2.8 保藏
西林瓶于-18 ℃冷冻保存。
1.2.4 样品均匀性的测定
1.2.4.1 菌种的水化
成品样品中金黄色葡萄球菌的数量以最终制成的样品在经40 mL无菌生理盐水水化后，金黄色葡萄球菌浓度约104CFU/mL。
1.2.4.2 均匀性的测定
制备后的成品中随机抽取10份，每瓶2个重复进行均匀性测试，使用单因素方差分析中F检验对质控样品进行均匀性检验。
1.2.5 样品稳定性的测定
稳定性主要是考察质控样品长期和短期的稳定性及模拟运输条件下样品的稳定性。长期稳定性试验是通过均匀性检验的质控样品在-18 ℃条件下存放，分别存放0，7，14，21，30，60和180 d时随机选取2瓶测定金黄色葡萄球菌的含量。短期稳定性主要测定常温，-4 ℃和-18 ℃储存条件下随机选取6瓶测定金黄色葡萄球菌的含量。模拟运输条件下样品的稳定性主要是模拟快递运输环境，测定其菌体含量，用t检验进行统计分析。
2.1 金黄色葡萄球菌生长曲线的测定
微生物的生长曲线能体现出微生物不同生长阶段的特征，为研究金黄色葡萄球菌的生长规律和确定最佳菌体收获时间，以时间为横坐标，600 nm处吸光度为纵坐标，绘制金黄色葡萄球菌的生长曲线。由图2可以看出0～4 h为迟缓期，金黄色葡萄球菌生长速率常数为零代谢活力和耐受力不强，对不良环境的抵抗能力下降。从4 h开始进入对数期，生长速率代谢旺盛，不过这个时间菌体比较敏感，不易冷冻干燥，从12 h开始进入稳定期，活细菌数保持相对稳定，总细菌数达到细胞代谢产物积累达到峰，是生产的收获期，所以试验确定收获时间为12 h，选取恒温培养12 h的菌体作为后续冷冻干燥的对象。
图2 金黄色葡萄球菌生长曲线
2.2 冻干剂的筛选和优化
使用单因素分析法对金黄色葡萄球菌的冻干剂进行筛选，从表1可知，利用三因素方差分析研究海藻糖、蔗糖和大豆蛋白对于试验结果的影响关系，海藻糖呈现显著性（F=12.551，P=0.019＜0.05），说明主效应存在，海藻糖会对试验结果产生差异关系。具体差异可通过方差分析进行具体分析。蔗糖没有呈现显著性（F=0.062，P=0.941＞0.05），说明蔗糖并不会对试验结果产生差异关系。大豆蛋白没有呈现显著性（F=0.062，P=0.941＞0.05），说明大豆蛋白并不会对试验结果产生差异关系。
表1 冻干剂三因素方差分析结果
根据金黄色葡萄球菌的冻干剂正交试验，最终选择海藻糖添加量2%+蔗糖添加量6%+大豆蛋白添加量4%为金黄色球菌的复合冻干剂，保护率可达95.1%。
表2 冻干剂三因素正交试验统计表 单位：%
2.3 均匀性测定
从制备好的3个浓度样品中随机取10瓶做均匀性检验，3个浓度样品F值均小于临界值F0.05(9,10)=3.02，这表明在0.05显著性水平时，表明3个浓度质控样品组内不存在显著性差异，样品均匀性良好。
表3 均匀性检验统计表
2.4 稳定性检测
对一批经过均匀性验证的质控样品A在0，7，14，21，30，60和180 d时随机选取2瓶测定金黄色葡萄球菌的活菌数，试验结果和统计结果见表4。由于|b1|＜t(0.95,5)×S(b1)，表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，说明样品在观察的时间段内稳定。
表4 长期稳定性检验统计表
将制备好的样品A随机抽取18瓶分别在常温，-4℃和-18 ℃（每个温度存放条件下6瓶）的条件下分别在0，1，2，3，4和5 d测定活菌数，采用t检验进行统计分析，结果见表5。统计量|t|值小于临界值t0.05(34)=2.04，表明制备的质控样品在5 d内稳定。
表5 短期稳定性检验统计表
模拟运输条件下样品的稳定性主要是模拟快递运输环境，测定其菌体含量，用t检验进行统计分析，结果见表6。统计量|t|值小于临界值t0.05(34)=2.04，表明制备的质控样品在运输过程中稳定。
表6 运输条件稳定性检验统计表
此研究建立了一种运用真空冷冻干燥技术制备均匀性稳定性满足要求的金黄色葡萄球菌质控样品并对性能进行测试，筛选保护剂保证菌体存活率。质控样品可用于实验室内部控制、实验室间比对及实验室考核。
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