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叶如宪 陈大可
1.浙江中医药大学(浙江 杭州 310000);2.温州市人民医院(浙江 温州 325000)
目前,纳米材料广泛应用于各个领域,包括工程、化学、医学等[1]。
其中,纳米银制品由于其具有良好的杀菌效果,被广泛加入到各种材料中。
如一些食物保鲜材料就是利用纳米银制成,从而达到食物保鲜的效果[2]。
同时其也被用于一些妇女保健产品中,周玉海[3]等研究表明纳米银治疗萎缩性阴道炎效果显著。而纳米银避孕泡沫是利用纳米银研制的新型避孕产品,其主要成分为纳米银颗粒、辛苯聚醇(ON-9)以及赋形剂(聚乙烯醇材料等)。
是一种具有避孕、抗菌、润滑三效合一的避孕产品[4]。
相关研究表明其避孕效果显著,200 对育龄夫妇的避孕成功率为98.5%,效果受到受试者的认可,大部分人愿意继续使用[5]。
但是现阶段的研究仅局限于对纳米银避孕泡沫整体产品的避孕原理研究,而缺乏对其各组分的避孕作用的研究。
本研究拟通过探究纳米银避孕泡沫各组分及制剂对精子活力的影响,以深入了解其避孕机制,并为其功能效果的改善及相关避孕产品的研制提供基础和新思路。
一、实验材料
(一)供试品
20ppm 纳米银溶液(上海沪正纳米科技有限公司提供);1.2 辛苯醇醚(ON-9)原液(上海市西宝生物科技有限公司提供)、纳米银避孕泡沫剂原液(广东同德药业有限公司提供);赋形剂(上海市西宝生物科技有限公司提供);500ml 生理盐水(江苏四环生物制药有限公司提供)
(二)试剂耗材
1.人精液标本:9 份,选取有生育能力、禁欲7 天的男性精液,精子活动率≥70%,前向运动精子≥25%,畸形≤20%。
2.大鼠精液标本:美国斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,3 只,雄性,250 ～300g,由上海市西普尔-比凯实验动物有限公司提供,生产许可证号:SCXK(沪)2013-0016。
取SD 雄性大鼠双侧附睾置于无菌小烧杯中,NS 冲洗后加Tyrode 液4ml,用解剖剪在附睾尾划一十字形切口后,置37℃水浴箱孵育10 分钟后,取一滴于玻片上,低倍镜下(10×10)检查精子活率,要求活动率≥60%;符合条件后吸取0.1ml 加入装有1.9ml精子稀释液的小试管中,混匀,静置3min,取一滴于计数板中,高倍镜(10×40)下计数(方法:4 小格精子数×4×稀释倍数(20 倍)×104),根据计数所测得的密度,加Tyrode液将精液稀释到107/ml,置37℃水浴中待用。
3.精子稀释液:取NaHCO33g,,甲醛1ml,加蒸馏水100ml 配制而成。
4. 精子营养液(Tyrode 液):称取NaCl 4. 0g,KCl 0.10g,CaCl20. 10g,MgCl2·6H2O 0. 05g,NaH2PO4·2H2O 0.025g,NaHCO30.50g,Glucose 0.50g,用双蒸水分次溶解,配至1000ml,溶液配好后密闭,置4℃冰箱保存,实验前1 天配好。
(三)实验仪器
电子天平、生物显微镜、恒温水浴箱、涡旋振荡器,三通道计时器
二、实验方法(精子失活实验)
(一)预实验:将配制好的不同浓度的纳米银溶液、ON-9、纳米银泡沫剂、赋形剂、生理盐水和阳性对照组NP-9 分装于Eppendorf 管并置37℃水浴中保温待用。分别对大鼠及人精液进行体外抑精试验。
参照Sander-Cramer 法,以全部精子失活为终点,测出药物在20s ～3min 内的有效抑精浓度,根据预实验结果,确定正式试验剂量和分组。
(二)正式试验:根据预实验结果,我们确定了正式试验受试品浓度。
具体将配制好的不同浓度的纳米银溶液(20ppm、10ppm、5ppm、2. 5ppm)、ON-9(250ppm、125ppm、62.5ppm)、纳米银泡沫剂(1 ∶8 稀释、1 ∶32 稀释、1 ∶64 稀释、1 ∶128 稀释、1 ∶256 稀释)、赋形剂(原液、1 ∶2 稀释、1 ∶4 稀释、1 ∶8 稀释)、生理盐水和阳性对照组NP-9 分装于Eppendorf 管并置37℃水浴中保温待用。
对大鼠精液及人体精液进行体外精子失活试验。
(三)选择纳米银、ON-9 和赋形剂20 秒完全抑制精子的浓度及以下2 个浓度,共3 个浓度,分别观察并计算1min 时纳米银、ON-9 和赋形剂抑制对大鼠精子活力的抑制率(%)。
(四)参考上述纳米银避孕泡沫各组分有效抑精浓度和作用时间点,将配制好的20s 不能完全抑制大鼠及人精子活力的纳米银溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀释比赋形剂按1 ∶1 ∶1 混合后与大鼠精液作用,观察其在20s ～3min 内是否能完全抑制精子活力及作用时间点。
三、统计方法
实验结果利用SPSS 进行统计,数据描述采用均数±标准差的形式表示。
一、纳米银避孕泡沫各组分精子体外抑精药效学研究
(一)纳米银避孕泡沫各组分对大鼠精子体外抑精药效学研究
纳米银20ppm 体外20 秒内可以将大鼠精子全部抑制失活,10ppm 在2min 时可以将大鼠精子全部抑制失活,5ppm 则在3min 中内可以将大鼠精子全部抑制失活;ON-9 250ppm 体外20s 内可以将大鼠精子全部抑制失活,125ppm 在2min 时可以将大鼠精子全部抑制失活,62.5ppm则在3min 中内可以将大鼠精子全部抑制失活,赋形剂原液、1 ∶2 稀释及1 ∶4 稀释剂量体外20 秒内可以将大鼠精子全部抑制失活,1 ∶8 稀释剂量则在2min 内可以将大鼠精子全部抑制失活。
具体见表1。
表1 纳米银避孕泡沫各组分对大鼠精子的体外有效抑精浓度和时效关系
表1 纳米银避孕泡沫各组分对大鼠及人精子的体外有效抑精浓度和时效关系
(二)纳米银避孕泡沫各组分对人精子体外抑精药效学研究
纳米银20ppm 体外20s 内可以将人精子全部抑制失活,10ppm 在1min 时可以将人精子全部抑制失活,5ppm 则在3min 中内可以将人精子全部抑制失活;ON-9 250ppm 体外20s 内可以将人精子全部抑制失活,125ppm 在1min 时可以将人精子全部抑制失活,62.5ppm则在3min 中内可以将人精子全部抑制失活,赋形剂原液、1 ∶2 稀释及1 ∶4 稀释剂量体外20s 内可以将人精子全部抑制失活,1 ∶8 稀释剂量则在2min 内可以将人精子全部抑制失活。
这一结果与大鼠抑精活性结果类似。结果见表2。
表2 纳米银避孕泡沫各组分对人精子的体外有效抑精浓度和时效关系(续前页)
表2 纳米银避孕泡沫各组分对人精子的体外有效抑精浓度和时效关系
二、纳米银、ON-9 和赋形剂对大鼠精子抑制率
参考前面纳米银避孕泡沫各组分抑精有效浓度,我们选择20 秒能完全抑制精子的有效浓度及以下2个浓度(倍比稀释),共3 个浓度,进行了加药1min 时纳米银、ON-9和赋形剂抑制对大鼠精子活力的抑制率(%)实验,结果纳米银20ppm、ON-9 250ppm 和赋形剂1 ∶4 稀释在20s 内对精子活力的抑制率均为100%,三者各自浓度以下倍比稀释剂量对大鼠精子活力抑制率相应呈递减趋势,有明显的剂量-反应关系。
详细结果见表3。
表3 纳米银避孕泡沫各组分不同浓度精子活力抑制率(%)
三、纳米银避孕泡沫各组分混合后对精子作用的失活实验
(一)纳米银避孕泡沫各组分混合后对大鼠精子作用的失活实验
纳米银溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀释比赋形剂按1 ∶1 ∶1 等比例混合并与大鼠精液作用后,可在20s 内将大鼠精子全部失活,具体见表4。
表4 纳米银避孕泡沫各组分复方对大鼠精子的体外有效抑精浓度和时效关系
(二)纳米银避孕泡沫各组分混合后对人精子作用的失活实验
纳米银溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀释比赋形剂按1 ∶1 ∶1 三者等比例混合并与人精液作用后,可在20s 内将人精子全部失活,具体见表5。
表5 纳米银避孕泡沫各组分复方对人精子的体外有效抑精浓度和时效关系
当前避孕方法种类多样,例如口服避孕药、宫内节育器及避孕套等。
但不可否认的是这些避孕方法都有各自的缺陷。
以宫内节育器为例,性生活体位不正或是患有盆腔炎的妇女,很可能会引发性交痛,少数妇女还会出现经期延长和经血增多的情况[6]。
纳米银是一种阴道内的新型避孕药具,以乳白色的膨胀泡沫附着于阴道粘膜和子宫穹窿的方式来进行避孕[7]。
但是目前对于该款避孕泡沫的避孕机制的研究还比较少,本研究拟对纳米银避孕泡沫进行组分分解,利用各组分及其联合作用对大鼠及人精子活力的影响以探究其深层的避孕机制,为未来产品改良或其他避孕产品的开发提供一定的思路。
我们的研究结果提示,不管是作用于大鼠精子还是人精子,纳米银避孕泡沫及其各组分对精子具有灭活作用。
而且由我们的实验结果提示各组分对精子的杀伤作用随着各组分浓度的升高而增强,这与之前的相关研究结果类似,Yoisungnern[8]等发现纳米银可以明显抑制小鼠精子的生活力,且呈剂量应关系。
其可以诱发细胞凋亡、坏死、DNA 链断裂等[9]。
壬苯醇醚也对兔、狗、猴及人精子均有杀伤作用[10]。
在我们的实验中,赋形剂对体外精子也有一定的杀伤作用,这是在之前的研究中未曾涉及的。
而且上述三种组分在1 ∶1 ∶1的配比下,对精子杀伤具有协同相加作用,这为未来如何调整避孕泡沫的成分配比以加强其避孕效果提供了新的思路与方向。
本次实验以药效学为主,在纳米银避孕泡沫避孕机制方面,我们从以下几点进行研究。
纳米银主要通过抑制精子顶体酶活性,降低精子活力和穿透能力,改变精子形态来发挥杀精避孕的作用。
纳米银避孕泡沫各组分单独应用对人精子顶体蛋白酶活性,影响精子尾部膨胀率等(精子膜完整性指标)均有抑制作用,尤其对精子顶体蛋白酶的活性影响更为明显。
顶体蛋白酶位于精子的头部,它是一种丝氨酸蛋白溶解酶,当精子与卵子的透明带结合时,顶体酶将活化为二者的结合提供能量,而纳米银则可以抑制顶体蛋白酶的活性,从而阻止精子与透明带的结合,达到避孕的效果。
通过进一步的研究,将纳米银泡沫各组分混合应用后则可以起到协同的作用,更好的抑制人精子顶体蛋白酶活性,影响精子尾部膨胀率等,从而达到更高效、更安全的避孕效果;然而,作为精子能量代谢重要物质的乳酸脱氢酶,纳米银各组分及混合应用后对人精子乳酸脱氢酶活性则未见明显抑制作用。
纳米银避孕泡沫成分复杂,在未来可以探索其可能涉及的其他避孕机制,丰富人们对其认识,从而正确开发、对待与使用避孕产品。
纳米银避孕泡沫各组分(纳米银、ON-9 和赋形剂)单独使用均具有明显抑精活性,且三种成分混合具有协同相加作用。
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