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赵媛 贺倩 谢永臻 张为 梁柏堂
多肽芯片即多肽阵列,是将已知的蛋白质一级序列按序列漂移原则分解成重叠肽段,并将多肽片段作为分子探针固载至载体机制表面形成高密度阵列。多肽芯片包含了蛋白质的全结构,保留了蛋白质的部分功能,与蛋白质相比具有更优越的化学稳定性［1］。随着固相多肽合成(solid phase peptide synthesis,SPSS)技术快速发展,多肽芯片为蛋白质组学提供了快速、易于操作、高通量的研究方法。
依据多肽芯片的用途可以将其分为功能型多肽芯片和分析型多肽芯片［2］。功能型多肽芯片多为探究蛋白分子与其他生物分析信息［3］,故对每一阵列点上肽段纯度要求不高。对于短肽(<20 个氨基酸)而言,纯度>80%即可应用于功能性检测［4］。在多种多肽原位合成(in situ synthesis)方法中,SPOT 斑点合成法运用最为广泛。该方法最先由Frank 等［5］提出,将已知蛋白的一级氨基酸序列按照序列漂移原则,将活化的氨基酸点印至在平面载体上逐步合成多肽阵列,具有试剂消耗量极少、肽段纯化简便无需结晶、固定化操作和可合成非天然肽段等优点［6］。分析型多肽芯片直接将预先合成(off-chip synthesis)后的多肽片段固定至载体上,在低分析物浓度下提供足量的结合位点,特异性结合目标大分子后进行定性或定量分析,是目前为止应用最为广泛的类型［2,4,7］。如Voss 等［8］利用多肽阵列芯片和基于乳胶颗粒凝集法系统性筛查新冠肺炎病毒抗体,发现用芯片法检测血清更为敏感,可以利用多肽芯片技术同时检测数百个突变体,以评估突变位点对抗体药物反应的影响。
多肽芯片技术包含4 个基本过程：阵列构建、探针/样品固载、理化检验及结果分析。多肽微阵列芯片检测流程见图1。其中,将探针/样品固载至载体上最为关键,直接影响芯片质量。载体材料不仅对固载物即探针或样品有强吸附能力,同时要保持其构象和稳定性,在检测时具有高响应、高灵敏度和低背景等优点。目前,多肽芯片常用的载体主要包含玻片［9,10］、化学膜［7,11-13］(硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF 膜等)、凝胶［14］和各种复合材料［15,16］等。凝胶作为多肽芯片载体可提供多孔亲水环境,易于保持探针分子活性和稳定性,但后续反应液移除较为麻烦。复合材料作为多肽芯片载体具有良好的响应值和灵敏度,但其高昂成本限制了商业化应用。玻片具有价格低廉、背景信号低等优点,其表面经过化学基团活性修饰后具有更高的固载能力［17］,提高了阵列密度,实现高集成高通量,但其使用前需要经过繁琐的化学改性。化学膜表面具有非特异性吸附易造成较高的背景,但其具有较高的化学稳定性、机械强度,后续封闭实验操作可有效降低其背景干扰、减少非特异性吸附,拓展其在多肽芯片甚至生物芯片领域应用。Guo 等［11］采用斑点合成技术在载玻片上自制覆盖严重急性呼吸综合征(SARS)病毒全蛋白的多肽芯片,分别与急性患者、康复期患者血清反应,发现了被多种康复期血清识别的表位,这些表位对于开发相应抗体药物及疫苗具有重要作用。
图1 多肽微阵列芯片检测流程［2］
芯片点印可采用手动式和机械式,机械式点印的精度、速度、样点均一性等优点更为突出。多肽芯片的点印方式可分为接触式和非接触式。接触式点印法适合将大量不同的多肽或氨基酸溶液点印至一张芯片上；
非接触式点印法适合批量制备特征芯片［15］。由药明激创(佛山)生物科技有限公司开发的自动化多肽阵列合成仪,将所需制备的氨基酸序列(可包含非天然氨基酸)输入软件,按照客户需求分解成肽段并在功能化纤维素膜上形成高密度肽阵列,现已成功制备了新冠病毒突变体奥密克戎S 蛋白多肽芯片,助力新冠病毒疫苗开发和药物开发。
多肽芯片完成相应的理化检验后需检测仪器记录结果并分析。目前常用的多肽芯片检测方法有直接检测法和间接检测法。常用的直接检测法包括表面加强激光解析离子化飞行时间质谱技术(surface enhance laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)、表面等离子体共振检测技术(surface plasmon resonance,SPR)等［18,19］,这些方法无需对靶标分子进行标记即可检测到芯片上探针分子与其相互作用,但对昂贵仪器的依赖度较高,应用受到限制。间接检测法是将示踪物标记于靶标分子上,通过检测标记信号强弱来分析样品信息。常用的间接检测法包括放射性同位素示踪法(isotopic tracer method)、化学发光法(luminesence)、荧光染料标记法、亲和素标记法等［9,20-22］。同位素示踪法容易给环境带来放射性污染,化学发光法因操作简便、检测试剂低廉和检测仪器易于使用优点得到更为广泛的应用。
多肽芯片是一种高通量、平行化的检测手段,能够在较短时间内准确且快速的获取待测样品信息,效率显著优于传统方法。这些特点使其在药物筛选中显示出巨大的作用力［23］,不仅为药物应用提供理论依据,还能为药物设计和开发提供指导,缩短药物开发周期,加速药物筛选［24-27］。
3.1 药物开发筛选 药物开发过程中筛选出有效的药物并进行验证是非常重要的环节。传统的药物开发需要从动植物组织或微生物中提取分离出先导化合物,并进行多步骤的人工修饰,既费时又耗力。利用功能型多肽芯片和分析型多肽芯片对蛋白质分子进行体外研究,可快速获取药物作用靶点。Domenyuk 等［28］发现了一种新的筛选抗菌药物的方法。他们将10000 个20 个氨基酸长度的肽段固定至聚合物表面形成高密度的多肽阵列,对多种细菌外部和细胞内部分别用染料标记,鉴定了具有目标特异性结合的多肽或杀伤功能的多肽。具有结合功能但无杀伤功能的多肽会产生两种荧光颜色,而具有结合功能及杀伤功能的多肽仅产生一种信号。研究小组将筛选出的肽段依据浓度梯度阵列固载,鉴定出了抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌生长的多肽,其最低抑制浓度(MIC)为20 μM。该方法有显著的优点：首先芯片可同时筛选多种细菌,节省了验证时间；
其次,该方法快速,在1 d 内可完成细菌标记、筛选和检测分析。此外,采用固相合成法可将非天然氨基酸引入肽库,能够直接筛选对蛋白酶稳定的肽。
3.2 药物作用靶点筛选 药物作用靶点是指药物分子在生命体内相互作用的结合位点,包括基因位点、核酸大分子、受体、酶、小分子肽、离子通道等。
对于化学类药物,一般通过查询先导化合物并对其进行修饰改性等达到药物作用［29］。Meli 等［30］利用多肽阵列芯片联合计算机辅助药物设计寻找新药,他们通过计算机模拟用于抑制癌症生长的非肽小分子先导物结构信息,找到了一种命名为shepherdin 的肽(肽段序列结构GNNQQNY),其具有抗癌作用。以该肽短的结构为母核进行相应的化学修饰,并将修饰后的肽段制备成多肽阵列,运用酶联免疫吸附实验(ELISA)测试其与底物三磷酸腺苷(ATP)、N-末端热休克蛋白90(N-Hsp90)的反应。通过浓度梯度研究发现多肽与Hsp90 的N 端结合具有特异性和饱和性。
对于生物药如蛋白药物和抗体药物,单从结构上是较难推断药物的靶点,可以用多肽芯片查找可能的药物靶点。Wang 等［31］及Li 等［32］设计和开发的SARS-CoV-2 病毒蛋白质组多肽芯片,包含966 个多肽片段和纯化的S 蛋白、N 蛋白和E 蛋白探针,每一肽段包含15 个氨基酸且相邻肽段间有10 个氨基酸重叠。该多肽芯片具有高灵敏度(94 pg/ml)、重复性良好(r=0.99),仅需要1.5 h 就可实现新冠病毒感染者血清血浆中抗体检测,并可精确到抗体氨基酸表位。多肽阵列技术鉴定出抗体表位的氨基酸表位序列FRKSN,结构分析了体结合到S-RBD-ACE2 复合体的表位位置并预测中和性抗体。他们在患者血清中首次发现中和性抗体可能结合到靶标刺突蛋白的线性表位(456-FRKSN-460),随后该表位结构在同行的研究者中得到证实［33］。这些鉴定出的表位结构,对于新冠病毒抗体药物研发及疫苗研发、广泛筛选现有的广谱抗病毒药物、临床免疫动态检测和快速分析患者血清以指导用药具有指导意义。Guo 等［11］在功能化纤维素膜上原位合成了覆盖SARS 病毒全蛋白的多肽芯片,该芯片上包含4942 个多肽片段。将多肽芯片与患者血清反应,再与辣根过氧化物酶标记的山羊抗人免疫球蛋白(Ig)G、IgM 或IgA 在37℃下孵育1 h,然后用ECL 化学发光试剂处理,通过鉴定阳性斑点氨基酸序列识别抗原表位。这些识别到的表位对于开发相应抗体药物及疫苗具有重要作用。
3.3 药物活性筛选 药物治疗过程中,筛选出合适的药物能降低药物使用风险,提高药物使用者生活质量［34］。利用多肽芯片,可以测定不同药物在体内药效作用。苏敏等［22］开发出了一种基于多肽微阵列芯片的荧光和共振光散射双通路检测方法来筛选凝血酶抑制剂。具体流程见图2。用生物素标记芯片上肽片段C 端,凝血酶将水解多肽上的特异性位点作用,用荧光探针和30 nm 金纳米粒子探针捕获水解反应释放的生物素。通过荧光和共振光散射信号强度的变化检测抑制剂的抑制能力。该方法测定的3 种凝血酶抑制剂 ［阿加曲班、抗凝血酶Ⅲ和丝氨酸蛋白酶抑制剂(AEBSF)］在酶溶液中的半抑制剂浓度(IC50)测定值与文献报道相符；
在血浆样本中测到的IC50值大小与酶溶液中相符；
在加标血清中测定IC50值有差别,但是抑制能力是一致的(阿加曲班>抗凝血酶Ⅲ>AEBSF)。可见多肽芯片技术对样品测定具有高度特异性、稳定性、结果可量化显示,有助于判断抑制剂的实际使用价值。
图2 基于多肽微阵列芯片的荧光法和共振光散射法检测凝血酶抑制剂
郭明日等［35］同时采用多肽微阵列、MGIT960 药敏和罗氏比例法检测结核分枝杆菌(MTB)耐药性,选择3 种方法检测均为阳性的446 例患者标本进行异烟肼(INH)和利福平(RFP)药敏测试,比较三者检测结果的差异性。结果分别以MGIT960 药敏结果和罗氏比例法为参照,微阵列芯片法检测MTB 对INH 和RFP 耐药性的灵敏度、特异度、Kappa 值接近,表明微阵列芯片法和另外两种方法对INH 和RFP 耐药性的检测具有极好的一致性。而MGIT960 药敏和罗氏比例法药敏不一致的MTB 样本采用微阵列芯片法检测,结果显示,芯片法测定的INH 和RFP 耐药性与MGIT960 药敏一致和罗氏比例法测定也有差异,可能MTB 样本存在异质性耐药。微阵列方法与经典测定方法相比,测定INH 和RFP 耐药性具有较高的一致性,且具有快速、精准、较高的灵敏度和特异度。
3.4 中药筛选 中药及其复方具有多成分、多环节、多靶点协同作用等特性,凭借这些优势发挥不可替代的作用,同时也为中药研究带来困难。国内已有人利用多肽芯片技术对中药进行研究。发明者［36］在纤维素膜上制备了能够与从不同产地的人参中提取的人参总蛋白发生特异性反应的多肽阵列,用于鉴别人参产地。不同产地人参蛋白种类及含量不一样,通过提取人参根部蛋白质并进行标记,将其与多肽微阵列芯片反应,通过发光区域和发光斑点可判断提取蛋白质种类和含量,从而推断其产地。发明者将多肽阵列芯片在再生后,重新测定样本,其结果具有高度的一致性。玄毅等［37］利用SELDI 多肽芯片技术监测注射鱼腥草后不同天数狗血清中蛋白质,发现狗血清中3511Da 与3522Da、3960Da 与3975Da 四种蛋白含量随中草药鱼腥草的注射天数有显著变化。采用该芯片技术可快速监测到血液中蛋白含量变化,这些蛋白值的变化对中草药鱼腥草作用靶点筛选和药物不良反应监控有辅助意义。由此可见多肽芯片技术在复杂的中药研究当中表现出明显的优势。
多肽芯片技术所具有的样品用量少、稳定性好、灵敏度高、快速平行检测、结果可量化显示等优点,使其成为蛋白质组学和药物开发的有力工具。芯片上的多肽探针分子较多级结构的蛋白分子,对温度、湿度、pH 值、有机溶剂的耐受性更高,易于保存,且经适当处理可实现再生重复使用。随着材料新技术的发展,可以在载体上制备更长更稳定的肽段以展示更多肽段空间构象,使其在药物研究表现出巨大的作用力。
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