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刘丽玲 李德玲 曾伟婷 张心怡 徐建刚 余敏斌
中山大学中山眼科中心 眼科学国家重点实验室 广东省眼科视觉科学重点实验室，广州 510060
青光眼是一种因视神经损伤导致视力丧失的疾病，其发病涉及到多基因和环境因素，其中病理性高眼压是其主要危险因素。临床上，多种系统性疾病和眼科疾病常用糖皮质激素类药物进行治疗，其长期使用可能会引起眼压升高，若不及时治疗会导致青光眼，甚至致盲。糖皮质激素进入靶组织后须与其受体(glucocorticoid receptor alpha，GRα)结合，受体通过改变构象并移位到细胞核中发挥作用。GRα与糖皮质激素配体结合诱导或抑制靶基因的转录可占人基因组的10%～20%[1]。有研究发现，地塞米松使细胞外基质中相关的降解酶减少，导致基质堆积在小梁网，同时使小梁网骨架交联成肌动蛋白交联网络[2-7]，这些变化引起房水流出受阻，最后导致眼压升高。随着生物基因组测序工程技术的快速发展，许多生物学实验数据不断积累，互联网上公布了不同类型的分子生物学数据库，如核酸数据库、基因表达数据库、蛋白组学数据库、代谢组学数据库等，并提供相关的数据查询和数据处理服务。以计算机为工具查找相关数据库，对生物信息进行储存、检索和分析是生物信息学的重要应用领域。目前常用的生物信息学研究主要包括差异表达基因(differentially expressed gene，DEG)、基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析和加权基因共表达网络分析。近年来研究者通过测序发现了激素类青光眼与正常人的差异表达基因及信号通路的变化，但是生物信息学工具分析的数据与实际并非完全相符，需要更多的实验验证结果。本研究拟借助GEO数据库寻找地塞米松致开角型青光眼的潜在靶基因并用体外实验加以验证，为激素性青光眼的精准治疗提供依据。
1.1 材料
1.1.1细胞来源 人眼原代小梁细胞(美国Sciencell公司)。
1.1.2主要试剂及仪器 DMEM低糖培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Trizol、lipofectamine RNAiMAX、DAPI(2145S35)(美国Invitrogen公司)；
地塞米松(美国Sigma公司)；
BCA蛋白浓度检测试剂盒(美国GLPBIO公司)；
兔抗人BDKRB1抗体(ab75148)(美国Abcam公司)；
鼠抗人TAGLN抗体(sc-53932)(美国Santa Gruz公司)；
兔抗人LMOD1抗体(15117-1-AP)(美国Proteintech公司)；
兔抗人β-actin抗体(4970)、兔抗人GAPDH抗体(5174S)、山羊抗兔二抗(7074S)、马抗鼠二抗(7076S)(美国CST公司)；
ECL化学发光液(美国Merck Millipore公司)。超高灵敏度化学发光成像系统(ChemDoc Touch)(美国BIO-RAD公司)。
1.2 方法
1.2.1不同生物信息学方法对地塞米松处理眼小梁细胞生物学功能的评估
1.2.1.1通过GEO数据库检索激素类青光眼相关数据集 以“Dexamethasone AND Open-angle glaucoma”作为关键词在GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[8]数据库上搜索相关数据集，最后选定GSE16643、GSE37474和GSE124114。其中GSE16643基于GPL6480平台，使用Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F芯片，包含TM86和TM93各3组配对样本；
GSE37474基于GPL570平台，利用[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片分析，包含5组配对样本；
GSE124114基于GPL6244平台，利用[HuGene-1_0-st] Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array芯片分析获得，包含9组配对样本。
1.2.1.2GEO2R法分析小梁细胞差异基因 GSE37474、GSE124114和GSE16643数据经过GEO2R得到相应的差异基因，采用t检验和Benjimani-Hochberg方法计算校正后P值。选择有意义的差异基因标准为Log2倍数变化(fold change,FC)绝对值>1且P.adjust<0.05。从中选择最有意义的基因，通过R软件以Log2FC为横坐标、-Log10(Pvalue)为纵坐标绘制GSE37474和GSE124114数据集差异基因的火山图。采用DAVID(http://david.ncifcrf.gov)[9]找出数据集之间的交集基因。
1.2.1.3GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)软件对数据集GSE37474和GSE124114进行富集分析 用1个预先定义的基因集中的基因来评估在以表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献。数据集选取MSigDB数据库中c2.cp.v7.2.symbols.gmt基因集合分析。Y轴代表1个基因集，X轴为每个基因集中核心分子对应的logFC分布情况；
每个基因集对应1个山峰，山峰的形状代表该基因集中核心分子的LogFC分布情况，其中峰高对应的位置代表大部分分子的logFC集中在这个位置；
图中每个峰下面还有1根小的竖线代表该组的核心分子，线越集中的位置说明该组数据在这个区间越集中，对应的是山峰的峰值；
如果对应的基因集NES为负值，则一般该基因集的峰会在0的左侧；
如果对应的基因集归一化富集分数(normalized enrichment score，NES)为正，则一般该基因集的峰会在0的右侧。一般认为满足错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.25且P.adjust<0.05即为显著富集[10]。
1.2.1.4GTEx Portal数据库查询正常人成纤维细胞中差异基因表达量 将GO分析得分最高组的相关基因群导入GTEx Portal数据库(https://www.gtexportal.org/)中，寻找基因群在人成纤维细胞的表达量每百万条reads的转录本(transcripts per million，TPM)[11]。
1.2.1.5线上STRING网站寻找差异基因蛋白互作网络 采用STRING(https://string-db.org/)[12]分析GSE16643、GSE37474和GSE124114差异基因的交集对应DEG的蛋白间网络分析。蛋白分子间物理和功能联系通过智能计算预测、高通量实验、共表达网络等得出。设置蛋白间interaction score>0.4阈值并绘制相应的网络图。采用Cytoscape v3.6.6软件可视化并构建蛋白间互作网络[13]，相互连接最多的节点称为关键节点(hub nodes)[14]。
1.2.1.6线上JASPAR和UCSU数据库寻找相关转录因子 将上述生信工具找到的差异基因输入UCSC(genome-asia.ucsu.edu/index.html)[15]寻找相关启动子序列，并与JASPAR(https://jaspar.genereg.net)[16]连接寻找转录因子和结合位点信息。
1.2.2实验观察地塞米松对培养小梁细胞的影响
1.2.2.1细胞培养及分组 第2～6代原代细胞复苏后培养在含体积分数10% FBS的DMEM低糖培养基中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。待细胞生长融合达90%时进行传代培养，取处于对数期的细胞加入500 nmol/L地塞米松2 ml培养7 d，设为地塞米松组。对照组加入等体积乙醇溶液培养7 d。实验重复3次。
1.2.2.2Western blot法检测小梁细胞中BDKRB1和TAGLN蛋白表达 采用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白样品上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离蛋白转膜至PVDF膜。将膜放在快速BSA封闭液中封闭10 min，分别加入一抗BDKRB1(1∶ 800)、TAGLN(1∶ 500)、LMOD1(1∶ 1 000)、β-actin(1∶ 2 000)、GAPDH(1∶ 2 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入相应二抗(1∶ 2 000)，室温下孵育1 h；
加入超敏ECL化学发光液显色，采用凝胶成像系统采集图像，采用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin和GAPDH为内参，计算各组细胞中目的蛋白相对表达量。
1.3 统计学方法
2.1 数据集信息处理和差异基因筛选
GEO2R分析发现，GSE37474有15个有意义的差异基因，其中上调12个，下调3个；
GSE124112有13个有意义的差异基因，其中上调8个，下调5个(图1)。
图1 眼小梁细胞GSE37474和GSE124114差异表达基因火山图 蓝色代表表达下调基因，红色代表表达上调基因 A：GSE37474 B：GSE124114 FC:倍数变化
2.2 GSEA软件对数据集GSE37474和GSE124114的富集分析
经过软件分析，GSE37474和GSE124114基因集中满足FDR<0.25且P.adjust<0.05的数据集分别有250个和71个，其中GSE37474排名前10且与激素类青光眼有关的数据集有7个，分别为花生四烯酸代谢相关通路、细胞黏附分子相关通路、趋化因子信号相关通路、补体和凝血级联通路、细胞因子和其受体连接通路、细胞外基质受体连接通路和黏着斑相关信号通路；
其中，GSE37474排名前10且与激素类青光眼有关的数据集有4个，分别为补体和凝血级联通路、细胞外基质受体连接通路、黏着斑相关信号通路和溶解酶相关信号通路。可以看出补体和凝血级联通路、细胞外基质受体连接通路和黏着斑相关信号通路为共同信号通路(图2)。
图2 GSEA软件对数据集GSE37474和GSE124114富集分析比较 列出前10个差异基因富集且与激素类青光眼有关的通路
2.3 数据集间差异表达基因及其功能通路
根据样品信息和数据矩阵信息，用韦恩图得到GSE37474、GSE124114和GSE16643交集差异基因有89个；
在DAVID网站的功能分析GO发现这89个基因主要参与细胞外结构和基质的形成过程(图3)。经KEGG分析发现有3条信号通路与目标基因有关，分别是酪氨酸代谢、细胞色素P450药物代谢和脂肪酸生物合成途径。将GO分析得分最高、含有胶原的细胞外基质的基因在GTEx Portal数据库里寻找发现其主要表达在成纤维细胞中(表1)。
图3 GSE16643、GSE37474和GSE124114数据集交集的韦恩图与数据集交集差异基因的GO富集分析 A：3个数据集差异显著DEG的基因数韦恩图 紫色代表GSE124114；
粉色代表GSE16643；
绿色代表GSE374734 B：GO分析交集基因的功能组构成
表1 GSE124114、GSE37474和GSE16643数据集差异基因的GO富集分析含胶原的细胞外基质相关基因在正常成纤维细胞中的表达量Table 1 Relative expression of collagen-containing extracellular matrix-associated genes in normal fibroblasts of GSE16643,GSE37474 and GSE124114 datasets by GO enrichment analysis基因TPMSERPINA32.62COL8A22.44F3(TF)142.60MFGE8161.50NID1326.10OMD1.18SLPI2.08COL14A10.94GDF1523.82PRG40.83 注:GO:基因本体论;TPM:每百万条reads的转录本 Note:GO:Gene Ontology;TPM:transcripts per million
2.4 差异基因中的核心基因及其功能通路
为了从交集差异基因中筛选核心基因，89个基因经STRING网站上进一步分析，包含87个节点和50条关系线，平均聚类系数为0.28。其中与肌肉收缩相关的核心基因有LMOD1、ACTA2、MYL9；
与肌动蛋白结合相关的核心基因有LMOD1、TAGLN;与细胞溶质相关的核心基因有LMOD1、ACTA2、MYL9;与血管平滑肌收缩相关的核心基因有ACTA2、MYL9(表2，图4)。
2.5 与BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN相关的转录因子
在UCSC上找到基因的启动序列，结合JASPAR找到BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN的共同转录因子为SP1以及预测结合序列(表3)。
2.6 各组小梁细胞中BDKRB1、TAGLN和LMOD1蛋白表达量比较
Western blot分析显示，地塞米松组BDKRB1和TAGLN蛋白条带较对照组明显增强。地塞米松组BDKRB1和TAGLN蛋白相对表达量为1.32±0.14和0.44±0.09，高于对照组的1.00±0.00和0.20±0.10，差异均有统计学意义(t=-3.61、2.89，均P<0.05)。地塞米松组和对照组LMOD1蛋白相对表达量分别为0.56±0.02和0.49±0.07，差异无统计学意义(t=-1.71,P>0.05)(图5，6)。
表2 STRING分析得到的关键基因Table 2 STRING analysis of key genes among GSE16643,GSE37474 and GSE124114 datasets分类功能数目P值FDR核心基因GOTERM_BP_DIRECT肌肉收缩30.000 120.086 980 929LMOD1、ACTA2、MYL9GOTERM_MF_DIRECT肌动蛋白结合20.048 598 34723.870 702 52LMOD1、TAGLNGOTERM_CC_DIRECT细胞溶质30.087 212 63648.964 153 44LMOD1、ACTA2、MYL9KEGG_PATHWAY血管平滑肌收缩20.017 008 2868.463 993 952ACTA2、MYL9 注:FDR:错误发现率 Note:FDR:false discovery rate
表3 BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN基因相关的转录因子SP1及相关结合位点信息Table 3 Transcription factor SP1 and binding sites in BDKRB1,NID1,MFGE8 and TAGLN基因矩阵ID名称得分相对得分序列ID首端末端链预测序列BDKRB1MA0079.1MA0079.1.SP18.270.87Hg38_refGene_NM_000710783792+tgggcaggatNID1MA0079.1MA0079.1.SP18.890.89Hg38_refGene_NM_002508203212+gggggatggtMFGE8MA0079.1MA0079.1.SP18.780.89Hg38_refGene_NM_001310319109118_ttggctgggtTAGLNMA0079.1MA0079.1.SP19.740.93Hg38_refGene_NM_003186217226_ggggctggga
图5 地塞米松处理小梁细胞对BDKRB1蛋白表达影响 A：对照组和地塞米松组BDKRB1蛋白表达电泳图 B：对照组和地塞米松组BDKRB1蛋白相对表达量比较 与对照组比较，aP<0.05(独立样本t检验，n=3) GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶
图6 地塞米松处理小梁细胞对LMOD1和TAGLN蛋白表达影响 A：对照组和地塞米松组LMOD1和TAGLN蛋白表达电泳图 B：对照组和地塞米松组TAGLN蛋白相对表达量比较 与对照组比较，aP<0.05(独立样本t检验，n=3) β-actin:β-肌动蛋白
由于糖皮质激素在临床治疗中不可或缺，其产生的不良反应日益引起许多研究者的关注，其中研究较多的是地塞米松对眼房水流出通道的影响。本研究选取的GSE37474来自平均年龄65岁老年人群，而GSE124114是来自平均年龄为25岁青年人，但GSEA结果显示2个组的基因富集变化有相似结果。本研究选择富集分析中排名靠前的补体和凝血级联通路的BDKRB1蛋白表达进行分析，结果显示地塞米松会引起其表达增加。BDKRB1属于激肽激酶-激肽系统的组成部分，激肽是小分子多肽，当机体受到损伤时激肽能作为炎症和疼痛的调节分子。缓激肽(bradykinin，BK)、lys-BK、desArg9-BK和lys-desArg9-BK通过BDKRB1和BDKRB2 2个不同的受体发挥作用。lys-BK、desArg9-BK多肽能激活BDKRB1，而BK、lys-BK则激活BDKRB2。BDKRB1和BDKRB2均属于G蛋白偶联受体超家族的7个跨膜结构域，具有7个跨膜结构、1个胞外氨基末端和1个胞质羧基末端的共同结构[17]。BDKRB2分布广泛并调节大部分缓激肽的生物活动，然而BDKRB1在脑和脊髓正常的生理状态很难被检测到，在炎症或组织损伤时显著上调[18]。目前暂未见BDKRB1在眼小梁细胞中检出的报道，本研究结果显示地塞米松处理后该蛋白表达上调，可以监测其炎症反应活动的程度。
本研究中联合3个数据集GSE37474、GSE124114和GSE16643的差异基因的交集分析，在STRING蛋白互作分析中发现2个与骨架变化相关新的基因，即TAGLN和LOMD1。Leung等[19]研究显示，在地塞米松作用小梁细胞后经芯片测序检测出的TAGLN比正常对照组显著升高。TAGLN属于钙蛋白家族，编码一种对形状变化敏感的激动蛋白结合蛋白，但其具体作用仍需进一步研究。Leiomodin 1(LMOD1)是一种控制血管或内脏平滑肌收缩的蛋白，主要在甲状腺中高表达，同时也存在于眼部肌肉、骨骼肌和卵巢等组织中，主要在Graves甲状腺疾病和甲状腺相关眼部疾病中有报道[20]，目前尚未见该基因参与青光眼发病的报道。本研究结果显示，经过地塞米松处理体外小梁细胞，TAGLN蛋白相对表达量较对照组增加，但LOMD1蛋白未见显著增加。从STRING蛋白互作图可以看出，TAGLN与ACTA2相关，提示TAGLN参与小梁细胞在地塞米松作用下细胞骨架的变化。
GO富集分析部分主要集中在含有胶原的细胞外基质，过多的胶原堆积在小梁网会阻塞房水的流出，最终导致眼压升高[21]。本研究把GO富集分析得分最高的相关基因在GTEx Portal数据库中比对正常成纤维细胞表达，发现在成纤维细胞中也有这几个基因的表达。地塞米松处理的小梁细胞转化生长因子β产生增加，该细胞因子会促使小梁细胞转化为肌成纤维细胞[22]，而后者在胶原产生上起到关键作用。正常情况下，在组织受伤时肌成纤维细胞能一定程度修复缺失或损害细胞外基质，促进胶原的产生、分泌及收缩，进而产生瘢痕，如果失调会发生纤维化的可能。此结果提示地塞米松处理后可能存在小梁细胞的间充质转化过程。
本研究尝试寻找相关的转录因子，发现BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN这4个基因与SP1有关。SP1基因编码的蛋白是含有锌指结构的转录因子，参与细胞分化、转化、生长和凋亡，免疫反应，对DNA损伤的反应和染色质重塑[23]。ACTA2是肌成纤维细胞的标志物，Vimentin是肌成纤维细胞转化的中间产物，本研究发现SP1同时也是这两者的转录因子。虽然SP1在啮齿类动物和人类胚胎的发育上起到关键作用，在正常组织中一般随年龄增长下调，但在某些疾病，特别是肿瘤中发现SP1升高[24]。研究发现在无胸腺的小鼠中下调SP1能降低纤维肉瘤转变为纤维瘤的风险[25]，另外，Jin等[26]发现SP1介导的微小RNA(microRNA，miR)-4295可靶向肿瘤抑制因子p63a mRNA的3"非翻译区，抑制p63a翻译，进而促进正常尿道上皮细胞往上皮肿瘤发展；
致癌基因KRAS诱导MCF10a乳腺细胞的间充质转化是通过SP1介导对miR-200家族的抑制作用[27]，miR-200家族具有抑制Kras体外细胞转化和体内肿瘤形成的作用；
在对叶酸抑制药物培美曲塞耐药的非小细胞肺癌A400细胞的研究中发现，BMI1和SP1表达量较A549细胞上调，同时miR-145-5p下调，而SP1能促进间充质转化的发生[28]。鉴于SP1在上述研究中具有间充质转化功能，提示SP1可能参与了地塞米松处理后小梁细胞转化为肌成纤维细胞的过程。
综上所述，本研究通过一系列的生信工具找到地塞米松作用于小梁细胞后发生的变化，选取之前文献未报道的结果综合分析并关联其上游新靶点，为地塞米松导致的激素性青光眼的治疗提供了新的思路。然而生信分析的结果只是预测手段，仍需要更多实验验证该靶点的正确性。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明刘丽玲：直接参与选题、酝酿和设计实验、起草文章；
李德玲：实施研究、采集数据；
曾伟婷、张心怡：分析/解释数据；
徐建刚：修改文章；
余敏斌：对文章知识性内容的审阅和智力性内容的修改及定稿等
