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[摘要] 目的：建立快速柱前衍生-高效液相色谱法测定丙戊酸（VPA）血药浓度的方法。方法：选择ω-溴苯乙酮为衍生试剂，环己烷羧酸为内标，Hypersil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为分析柱；流动相为甲醇-水（75∶25，V/V)，检测波长为248 nm，流速为1.0 ml/min。血样经酸化后以二氯甲烷提取。结果：内标环己烷羧酸和VPA的保留时间分别为8.0 min和12.8 min，线性范围为25～200 μg/ml，平均回收率为100.61%，日内、日间RSD均小于4.19%。结论：本法快速、简便、准确，适合临床常规监测需要。
[关键词] 柱前衍生；高效液相色谱法；丙戊酸钠；血药浓度
[中图分类号] R286.0 [文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）06（a）-049-02
HPLC determination of plasma concentrations of valproic acid
DENG Fang
Department of Pharmacy, Second People"s Hospital of Hunan Province, Changsha 410007, China
[Abstract] Objective: To establish a rapid pre-column derivatization-high-performance liquid chromatography determination of valproic acid (VPA) plasma method. Methods: ω-bromoacetophenone as a derivative reagent, cyclohexane carboxylic acid as the internal standard, Hypersil ODS-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5μm) for the analytical column; mobile phase was methanol-water(75:25, V/V), detection wave length was 248 nm, flow rate was 1.0 ml/min. Blood extracted by dichloromethane after acidification. Results: The internal standard cyclohexane carboxylic acid and VPA respectively, the retention time of 8.0 min and 12.8 min, the linear range of 25-200 μg/ml, the average recovery was 100.61%, days, day RSD were less than 4.19%. Conclusion: The method is rapid, simple, accurate and suitable for routine monitoring of clinical need.
[Key words] Pre-column derivatization; High-performance liquid chromatography; Sodium valproate; Blood drug concentration
丙戊酸作为癫痫小发作、大发作和肌阵挛的首选药物之一，一直是临床医生常用的抗癫痫药物。但由于其治疗窗窄、个体差异大，中毒症状与癫痫症状相似而使其使用受到限制。近年来，有关丙戊酸血药浓度监测的文献报道较多，有气相色谱法[1]，荧光偏振免疫法[2]，散射免疫比浊抑制法[3]，高效液相色谱法[4-7]等。本文建立了以ω-溴苯乙酮为柱前衍生化试剂，能快速有效测定人血清中丙戊酸的高效液相色谱，现报道如下：
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1100 型高效液相色谱仪，高速离心机（上海安亭科学仪器厂），旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）、超声仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）TU-1901双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。
1.2试剂
丙戊酸钠（湖南湘中制药有限公司提供）；环己烷羧酸；ω-溴苯乙酮（化学纯CP国药集团化学世纪有限公司）；甲醇为色谱纯；二氯甲烷、三乙胺均为分析纯。
2 方法与结果
2.1色谱条件
Hypersil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（75∶25，V/V）；检测波长为248 nm；流速为1.0 ml/min，柱温：室温。
2.2相关溶液的配制
2.2.1 VPA标准溶液的配制取VPA置25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到VPA标准贮备液，保存于冰箱备用。
2.2.2 内标液的配制取内标环己烷羧酸100 mg置容量瓶中，用0.2 mol/L氨水稀释至刻度，再取该液4 ml，置25 ml容量瓶中，用0.5 mol/L氨水稀释至刻度，得到环己烷羧酸内标液浓度为160 mg/L，保存于冰箱备用。
2.2.3衍生化试剂的配制精密称取ω-溴苯乙酮100 mg置10 ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，保存于冰箱备用。
2.2.4 碱化液的配制精密吸取0.2 ml三乙胺置100 ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，保存于冰箱备用。
2.3 样品处理
取样品血清50 μl于带盖的圆底塑料管中，加内标液环己烷羧酸50 μl后，再加100 μl，1 mol/L的硫酸，混合摇匀，加入二氯甲烷2 ml，于旋涡混合器振摇3 min，离心6 min，弃上层，精密吸取下层0.5 ml置尖底塑料管中，加入50 μl的衍生化试剂（ω-溴苯乙酮）和50ul碱化试剂（三乙胺），于45℃水浴蒸干。残渣用100 μl甲醇复溶，取20 μl进样分析。在上述色谱条件下测定，记录内标及样品的色谱图，色谱图见图1、2。
2.4标准曲线
取VPA适量置试管中，用甲醇稀释至２ ml，得VPA分别为25、75、100、150、200 mg/L的系列标准溶液。取标准液50 μl，用50 μl的空白血清复溶后。以VPA浓度（Ｃ）对所测VPA峰面积与内标峰面积之比（R）进行线性回归分析，得回归方程为：c=201.918 1×R－15.094 7，r=0.9 990（n=5）结果标明VPA在25～200 mg/L浓度范围内线性关系良好。
2.5 方法回收率
计算回收率、日内和日间RSD，结果见表1。
2.6精密度试验
在同一天和连续5 d对低、中、高3种质量浓度（25，100，
200 mg/L）的血清样品按照“2.3”项下方法处理后进样，测定。每种质量浓度日内平行做5次，分别计算日内和日间精密度，结果见上表1。
2.7 稳定性试验
制含VPA浓度为25、100、200 mg/L的血清样品2份，72 h后测定。两药含量下降均小于3%，表明血清中含量72 h内未发生明显变化。
2.8灵敏度试验
以S/N大于等于3计，VPA的最低检测限为10 mg/L。
2.9干扰试验
在含有丙戊酸钠的血清中加入抗癫痫药物卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠对照液适量，然后按照“2.3”项下方法处理进样，结果显示其他药物并不对其产生干扰[8]。
3 讨论
丙戊酸钠是临床上常用的抗癫痫药，主要用于单纯或复杂失神发作、肌阵挛发作、全身强直阵挛性发作（大发作）的治疗,对复杂部分性发作也有一定疗效。丙戊酸的药代动力学和疗效个体差异较大，故检测其血药浓度来调整剂量是确保疗效和用药安全的必要手段。丙戊酸钠为有机酸丙戊酸的钠盐，其甲醇溶液没有紫外吸收，而丙戊酸的甲醇溶液经过柱前衍生，在248 nm处有一最大吸收峰，故选检测波长为248 nm。本试验选用ω-溴苯乙酮为衍生试剂，能达到有关文献选用2-溴-对硝基苯乙酮的效果，且效果理想，容易购买。有文献用正戊烷提取效果满意，但实验条件较高，本试验选用二氯甲烷一次提取，一样达到了令人满意的结果。较采用冠醚混悬液或乙醚混合液提取更为方便快捷,且相对成本更低。
为使内标和丙戊酸钠的衍生化反应结果稳定，峰面积比值稳定，在吸取上清液时应小心操作,不要带入水层。因此根据笔者测定的经验,当内标峰面积低于3 000 000时，应考虑重做。
[参考文献]
[1]马虹英,李新中.气相色谱法测定血浆中丙戊酸浓度的方法改进[J].中国临床药学杂志,2002,13(9):544.
[2]崔一民,孙培红,刘玉旺,等.高效液相色谱-荧光检测法测定人血清中丙戊酸钠浓度[J].中国药房,2005,16(4):287.
[3]金燕.散射免疫比浊抑制法检测卡马西平、丙戊酸浓度[J].中国医院药学杂,2001,21(9):519.
[4]陈湛芳,胡朝欣,王志燕,反相高效液相色谱法测定血清中丙戊酸浓度[J].中国医院药学杂志,2001,21(8):458.
[5]陈坚,方维军,吴芳.高效液相色谱法测定丙戊酸血药浓度[J].中国临床药学杂志,2000,9(5):296.
[6]胡永狮,吴平,黄惠丽.衍生化法测定癫痫患儿血清中丙戊酸的浓度[J].华西药学杂志,2001,16(6):434.
[7]郝润喜,闫彩萍,刘玉玺.高效液相色谱-柱前衍生法测定丙戊酸血药浓度[J].药物分析杂志,1997,17(3):172.
[8]Dodson WE.Special pharmacokinetic considerations in children[J].Epilepsia,1987,28(Suppl 1):56.
（收稿日期：2011-03-07）
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”
