【www.zhangdahai.com--班子述职报告】
【摘要】目的 观察川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用。方法收集眼科临床手术切除的人翼状胬肉标本，消化分离成纤维细胞，进行体外细胞培养。分别在pH为7.40和pH为6.00的条件进行，以无血清RPMI 1640培养液配制终浓度为4.0mg/ml、2.0mg/ ml、1.0mg/ ml、0.5mg/ ml和0.25mg/ ml的川芎嗪药液，0.02%的丝裂霉素C（MMC）作为阳性对照组，pH为7.40和/或pH为6.00的RPMI 1640培养液作正常对照组，对体外培养的胬肉成纤维细胞进行作用。通过光镜观察对细胞进行计数；四甲基偶氮唑盐（MTT）技术检测显示细胞存活率，间接免疫荧光技术检测细胞波形蛋白（Vimentin）的表达。结果 细胞计数和MTT法检测结果显示，在pH为7.40的条件下，与正常1640培养液组比较，4.0mg/ml的川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞均有明显的抑制作用（P＜0.001）。在pH为6.00的条件下，与正常1640培养液组比较，不同浓度的川芎嗪和pH为6.00的1640培养液对人翼状胬肉成纤维细胞均有明显的抑制作用，与pH为6.00的1640培养液组比较，4.0mg/ml的川芎嗪对人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用明显强于其他浓度的川芎嗪，0.5mg/ml和0.25mg/ml的川芎嗪可明显促进人翼状胬肉成纤维细胞的生长（P＜0.001）。结论川芎嗪对人翼状胬肉成纤维细胞的生长具有双重作用，较高浓度的川芎嗪（4.0mg/ml）对人翼状胬肉成纤维细胞的生长有抑制作用。较低浓度的川芎嗪（0.5mg/ml、0.25mg/ml）在pH为6.00的条件下对人翼状胬肉成纤维细胞的生长有保护作用。
【关键词】川芎嗪翼状胬肉成纤维细胞作用
【Abstract】Objective To investigate the effect of tetramethylpyrazine in different concentration on pterygium fibroblasts in vitro. Methods Human pterygium samples were collected and then digested and separated and cultured in vitro. Cultured human pterygium fibroblasts of the 3rd passage were treated by different concentration of tetramethylpyrazine under the condition of pH7.40 and pH6.00, 0.02% mitomycin ( MMC ) and normal 1640 cultured solution . The tetramethylpyrazine was diluted in different final concentration 4.0mg/ml, 2.0mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml and 0.25mg/ml using RPMI 1640 culture solution without fetal calf serum under the condition of pH 7.40 or 6.00, respectively. The cells were observed and counted under light microscope. The biological activities of human pterygium fibroblasts were evaluated by methyl thiazoly tetrazolium (MTT) assay. The identification of human pterygium fibroblasts was detected by indirect-immunofluorescence method. ResultsBy cell counting and MTT assay, compared with normal control group under the condition of pH 7.40, the growth of pterygium fibroblasts was significantly inhibited in the concentration of 4.0mg/ml tetramethylpyrazine( P＜0.001 ). Under the condition of pH 6.00, compared with normal control group, the growth of pterygium fibroblasts was significantly inhibited in the different concentration of tetramethylpyrazine and 1640 culture solution with pH 6.00. The inhibiting effect of tetramethylpyrazine with 4.0mg/ml on pterygium fibroblasts was stronger than that of tetramethylpyrazine with other concentrations of tetramethylpyrazine. While the growth of pterygium fibroblasts was obviously promoted by tetramethylpyrazine with concentration of 0.5mg/ml and 0.25mg/ml( P＜0.001) under the condition of pH 6.00.Conclusions The tetramethylpyrazine has double effects on human pterygium fibroblasts in vitro. The higher concentration of tetramethylpyrazine ( 4.0 mg/ml ) could effectively inhibit the growth of the human pterygium fibroblasts under the condition of pH 6.00 or pH 7.40. The lower concentration of tetramethylpyrazine ( 0.5mg/ml and 0.25mg/ml ) could protect and promote the growth of pterygium fibroblasts under the condition of ph 6.00.
【Key Words】tetramethylpyrazine; pterygium；fibroblasts; effect
川芎嗪是从伞形科植物川芎的根茎中提取的有效成分，化学名为四甲基吡嗪，临床应用广泛，主要用于心脑血管等疾病的治疗。近年来，川芎嗪在眼科基础和临床研究的报道日益增多，如视网膜色素变性、青光眼、糖尿病视网膜病变等[1-4]。有研究表明，川芎嗪能有效抑制成纤维细胞的增生[5-6]。由于川芎嗪在酸性条件下溶解度较高，而在中性条件下，同样浓度的川芎嗪不易溶解，易析出。故本实验观察两种pH（7.40和6.00）条件下，川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的干预作用，为川芎嗪的基础研究提供研究数据，为翼状胬肉的防治提供疗效好的现代中药。
1材料和方法
1.1主要试剂仪器 RPMI 1640培养基（Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、胰蛋白酶（AMRESCO， 生工生物工程有限公司）、Ⅱ型胶原酶（Sigma公司）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（华美生物有限公司）、盐酸川芎嗪（西安力邦制药有限公司, 061001B）、注射用丝裂霉素（Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd）、四甲基偶氮唑盐（MTT）（MBCHEN公司）、40%甲醛（广州化学试剂厂）、Vimentin小鼠单抗（Santa Cruz公司）、Cy3标记二抗（Jackson公司）、CO2培养箱（德国宾德公司）、超净工作台（苏净集团安泰公司制造）、倒置显微镜（Carl ZEISS公司， Axinvert 200）、酶联免疫检测仪（BioTeK ELX-800）、紫外线分光光度计（日本SHIMADZU UV mini1240）、pH计（Sartorius PB-10）、荧光显微镜（Carl ZEISS公司， Axioplan 2 imaging）。
1.2方法
1.2.1川芎嗪的配制方法：称取一定量川芎嗪药粉溶于无血清的RPMI 1640培养基中，配置终浓度为4.0mg/ml的川芎嗪药液；然后采用倍比稀释法依次配置终浓度分别是4.0mg/ ml、2.0mg/ ml、1.0mg/ ml、0.5mg/ ml和0.25mg/ ml的川芎嗪药液，以pH计调节pH值为7.40和6.00的川芎嗪药液各一套，并调节相应pH值的RPMI 1640培养液各一份。
1.2.2翼状胬肉成纤维细胞体外培养及鉴定
1.2.2.1原代培养： 翼状胬肉组织标本来自中山大学中山眼科中心的翼状胬肉手术患者。本次实验采用在无菌条件下尽量将胬肉组织剪成小块，以1:1比例胰蛋白酶( 0.25% ) 和Ⅱ型胶原酶 ( 0.02% ) 混合液消化组织块40分钟，终止消化离心后，沉淀物用RPMI 1640培养基混合吹打均匀接种6孔板后，放入5％CO2培养箱中，37℃培养。RPMI 1640培养基内含15％灭活胎牛血清及青霉素100U/ml、链霉素100U/ml。原代接种后每天在倒置显微镜下观察接种细胞贴壁生长情况，3～5天换液一次。
1.2.2.2代培养：培养的原代细胞生长至80％汇合时，以0.25%的胰蛋白酶消化3 min，细胞悬液按1：2分瓶接种，完成一次传代。
1.2.2.3翼状胬肉成纤维细胞的鉴定：通过细胞的生长形态鉴定和波形蛋白免疫组化染色鉴定。间接免疫荧光组化染色鉴定方法：细胞悬液接种于铺有盖玻片的6孔培养板内，细胞爬满片后，4%的中性甲醛固定，抗原复性，3%过氧化氢阻断内源酶，正常羊血清封闭，加入波形蛋白抗体，4℃冰箱过夜，PBS洗涤后，加入Cy3标记的二抗1h，PBS洗涤，晾干，甘油封片，荧光显微镜观察。
1.2.3 川芎嗪对培养的翼状胬肉成纤维细胞影响的观察
1.2.3.1培养细胞的形态观察：不同浓度川芎嗪药液作用48h后，在倒置显微镜下观察翼状胬肉成纤维细胞的形态变化，在高倍镜下随机选5个视野，计数，并照相。
1.2.3.2四甲基偶氮唑盐（MTT）比色试验[7]：取3代培养的翼状胬肉成纤维细胞，用含15%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基制成细胞悬液，以105/ml的密度接种于96孔板中，每孔为200μl。培养24h后，弃去原培养液，相应每孔加入终浓度为4.0mg/ml、2.0mg/ ml、1.0mg/ ml、0.5mg/ ml和0.25mg/ ml的川芎嗪药液，0.02%MMC和不含胎牛血清RPMI 1640培养基，每孔各加200μl。 每组设3个复孔，培养48h后，在遮光条件下每孔加入5mg/ml的MTT液20μl，继续孵育4h，弃除各孔中的液体，相应各孔加入二甲基亚砜200μl，振荡10min，酶联免疫监测仪双波长模式（570nm、630nm）测各孔吸光度A值。细胞存活率=实验组A值/正常对照组A值。
1.3统计学分析
采用SPSS 11.0医学统计软件分析试验数据，结果以均数±标准差表示；同时采用方差分析进行各组均数的总体比较和两两之间比较，检验水平α=0.05。
2. 结果
2.1 体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的形态学特征
倒置显微镜下观察，传3代以上细胞在形态上无明显差异，均为贴壁生长，呈长梭形，胞核近圆形，位于细胞中央，胞体透亮，有的有分支突起。当细胞完全汇合后，呈漩涡状或放射状排列，细胞边界不清。培养的细胞爬片经间接免疫荧光技术检测细胞胞质中波形蛋白染色阳性，胞浆呈棕红色，结合培养细胞形态学特征及生长特性，可以确定培养的细胞为所需的成纤维细胞。见图1。
2.2 川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的影响
2.2.1川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用
在pH值为7.40和6.00的条件下，4mg/mL的川芎嗪药液处理组和0.02%MMC与其它浓度川芎嗪处理组及正常对照1640培养基处理组比较，体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞数量明显减少，P＜0.001，光镜下呈现胬肉细胞部分胞体破裂、溶解，细胞收缩、变圆，变小、数量减少，0.02%MMC的作用与其相似。在pH值为7.40条件下， 2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml的川芎嗪处理组与正常对照组比较，对人翼状胬肉成纤维细胞的生长无明显差别，P＞0.05；在pH值为6.00条件下，0.5mg/ml和0.25mg/ml的川芎嗪处理组与pH=6.00的1640培养液对照处理组和其他浓度川芎嗪处理组比较，可明显增加人翼状胬肉成纤维细胞的数量，P＜0.001，（见表1、图2）。结果表明， 4mg/mL的川芎嗪药可明显抑制人翼状胬肉成纤维细胞的增殖。在pH值为6.00条件下，0.5mg/ml和0.25mg/ml的川芎嗪对人成纤维细胞的生长有保护作用。
2.2.2川芎嗪对人翼状胬肉成纤维细胞的活性影响
在pH为6.00的条件下，不用浓度川芎嗪处理组、1640培养液处理组和0.02%丝裂霉素处理组与pH为7.40的1640培养液处理组比较，对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的生存率均有明显的抑制作用，4mg/ml的川芎嗪处理组作用最为明显，P＜0.001；0.5mg/ml和0.25mg/ml的川芎嗪处理组与pH=6.00的1640培养液处理组和其他浓度的川芎嗪处理组比较，对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的生长有明显的促进作用，P＜0.001, 见图3。。结果表明，在pH=6.00的条件下，4mg/ml的川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞有明显的抑制作用，而0.5mg/ml和0.25mg/ml浓度的川芎嗪可促进人胬肉成纤维细胞的生长。
在pH为7.40的条件下，4mg/ml川芎嗪处理组和0.02%丝裂霉素处理组与正常对照pH=7.40的1640培养液处理组及其余浓度的川芎嗪（2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml）比较，对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞生存率有明显的抑制作用，P＜0.001；其余浓度的川芎嗪处理组与正常对照组比较，对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞生存率的影响，无明显差异，P＞0.05,见图3。结果表明，在正常pH值条件下，4mg/ml的川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞有明显的抑制作用，较低浓度的川芎嗪（2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml）对人胬肉成纤维细胞的抑制作用不明显。
3讨论
翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，目前仍以手术治疗为主，但术后复发率较高。病理学研究表明，初发及复发的翼状胬肉主要组织成分是大量增殖的成纤维细胞[8]。川芎嗪作为一种Ca2+拮抗剂，通过与Ca2+通道受体可逆性结合，调节Ca2+的细胞内流量，具抗自由基，抗氧化能力而起到抗细胞凋亡和神经保护作用的作用[2,9,10]，此外，川芎嗪还具有扩张血管、调节脂质代谢、抗血小板聚、利尿等作用。
本试验以体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞作为研究对象，采用光镜下观察细胞数量和MTT比色试验法检测成纤维细胞的存活率。与以往他人的实验研究不同，我们首次配置了pH值为6.00和7.40两套川芎嗪药液进行实验研究，首次考虑药液的pH值为实验影响因子，值得注意的是4mg/ml的高浓度川芎嗪药液有析出的特性，每次实验前须放置37℃水浴锅内预热5min。我们的实验结果显示，在pH=6.00和pH为7.40的条件下，4mg/ml高浓度的川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞均具有明显的抑制作用，而0.5mg/ml和0.25mg/ml川芎嗪在pH=6.00的条件下对人胬肉成纤维细胞具有保护作用。这一研究结果与以往其他人的报道不同[11]。临床上使用的川芎嗪注射液常呈现较低的pH值，一方面是由于川芎嗪本身是酸性物质，第二是为了增加川芎嗪的溶解度。较高浓度川芎嗪对人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用，可能是川芎嗪的毒性作用，使成纤维细胞死亡，抑制了成纤维细胞的生长；低浓度川芎嗪在酸性条件下表现出的促进人翼状胬肉成纤维细胞生长的作用，与以往报道的川芎嗪抗细胞凋亡相一致。
高低浓度的川芎嗪对人翼状胬肉成纤维细胞所起的负正作用，在临床上均具有重大意义，如川芎嗪的抗细胞凋亡作用可用于视网膜色素变性等神经疾病的防治，川芎嗪抑制细胞增殖的作用可用于抑制新生血管的生成和促进青光眼术后滤过泡的形成。关于川芎嗪对人翼状胬肉成纤维细胞双重作用的机制，仍需进一步研究。
本次试验结果证实了高浓度川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞有着明显的抑制作用，有望成为一种有效防治人翼状胬肉和防止其复发的中药制剂。
参考文献
[1] 何梅凤, 吴伟, 邓新国. 川芎嗪在眼科应用的研究进展[J]. 中草药,2007.
[2] 邓新国, 胡世兴, 贾小芸,等. 川芎嗪对rd和rds小鼠视网膜光感受器细胞干预作用的光镜观察[J]. 中草药，2006.
[3] 刘杏, 周文炳, 葛坚,等. 中药川芎嗪治疗原发性开角性青光眼视功能损害的疗效[J]. 中国实用眼科杂志, 1999.
[4] 姜士军, 曹晋宏. 川芎嗪离子导入治疗糖尿病视网膜病变疗效观察[J]. 国际眼科杂志, 2006.
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