【www.zhangdahai.com--村官述职报告】
(西安交通大学医学院第二附属医院心内科 陕西 西安 710004)�� 【摘要】 目的：探讨体外条件下罗格列酮(Rosiglitazone)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 诱导的大鼠血管平滑肌细胞(RASMC)增殖及结缔组织生长因子(CTGF) 表达的影响。方法：原代培养大鼠主动脉平滑肌细胞，静息48h后，分为对照组（Control group）、AngⅡ刺激组（AngⅡgroup）、AngⅡ＋Rosiglitazone组（AngⅡ＋ROS）。MTT法检测细胞增殖情况。实时荧光定量RT-PCR方法检测CTGF mRNA表达；免疫细胞化学法检测CTGF的蛋白表达。结果：(1)RASMC细胞低水平表达CTGFmRNA和蛋白,AngⅡ刺激可增加RASMC细胞CTGFmRNA和蛋白表达；(2)罗格列酮呈剂量依赖性抑制AngⅡ诱导的RASMC细胞CTGFmRNA和蛋白的表达。结论：在体外，罗格列酮可通过激活RASMC细胞PPARγ抑制AngⅡ诱导的RASMC增殖及CTGF转录和表达。�
【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体 血管紧张素 结缔组织生长因子 平滑肌细胞 罗格列酮�
【中图分类号】 R543
【文献标识码】 A【文章编号】1044-5511(2011)09-0192-02 ��
大量研究证实心血管系统重构在高血压、动脉粥样硬化、经皮冠状动脉腔内成形术后在狭窄等心血管疾病的发生发展中起重要作用，而血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞的增殖和表型的变化是导致血管重塑的主要病理基础。CTGF是一种新发现的促增生、促细胞外机制合成（致纤维化因子）。研究表明，AngⅡ－CTGF途径在血管重构中起重要作用。�
过氧化物酶体增殖物激活受体gamma（peroxisome prolixferator-activited receptor gamma，PPAR-gamma）属II型核受体超家族成员，被配体激活后作用于特异的DNA反应元件（peroxisome proliferator responsive element，PPRE）调控多种基因转录。研究表明，血管平滑肌组织中存在PPAR gamma表达，PPAR-gamma激动剂Rosiglitazone及Pioglitazone具有抗血管平滑肌细胞增殖等作用，但其具体机制不明。国外学者报道，PPAR-gamma激动剂可抑制TGFβ诱导的CTGF表达，考虑到AngⅡ在调节CTGF表达中，与TGFβ存在不同途径，本研究旨在研究PPAR-gamma是否可抑制AngⅡ诱导的CTGF表达及意义。�
1 材料与方法：�
1.1 主要试剂及仪器�
DMEM/F12培养基及胎牛血清（GIBCO）， 6孔板和25cm2细胞培养瓶（NUNC），BCA蛋白定量试剂盒（PIERCE），TRIzol reagent（Invitogen），SuperScriptTMⅢ Platinum?两步法RT-qPCR试剂盒,兔抗大鼠CTGF抗体（abcam）,兔抗大鼠ColⅢ抗体（santa cruz），生物素标记山羊抗兔IgG（PIERCE），BCA蛋白定量试剂盒（pierce），SupersignalTM WEST Pico化学发光试剂盒（PIERCE），AngiotensinⅡ(Sigma), GW9662（Sigma），BADGE（Sigma），pioglitazone（Cayman）,15d-PGJ2(sigma)，ABI PRISM 7000 实时定量PCR仪(ABI)，高通量多功能微板测试系统（BMG）。�
1.2 方法�
1.2.1大鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养及传代�
参见文献[5]。颈椎拉脱处死大鼠后，无菌条件下开胸取胸主动脉，长约1.5 cm，仔细剥离血管周围结缔组织，分离外膜，刮除血管内皮组织，剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，D-Hank’s液冲洗，平贴于一次性培养瓶中，缓慢加入含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的F12/DMEM培养基，置5％CO2、37℃孵箱培养，待细胞长至单层后0.25%胰酶消化传代（3～7代）。实验用细胞在生长至亚融合状态时，以含0.4%血清的DMEM培养48ｈ，使其同步化。�
1.2.2 细胞预处理�
药物干预细胞分为4组，即对照组（Control）； AngⅡ刺激组（AngⅡ）（10-7mol/Ｌ的AngⅡ刺激24h）； Rosiglitazone预处理组（AngⅡ＋Ros），即罗格列酮(10-5，5×10-6，10-6mol/L)预孵育2ｈ后，加入10-7mol/Ｌ的AngⅡ继续培养24ｈ；阳性对照组，即Pioglitazone（50μmol/L）、15d-PGJ2(5μmol/L)预处理2h后，加入10-7mol/Ｌ的AngⅡ继续培养24ｈ；PPAR-gamma拮抗剂组，即GW9662(3×10-6mol/L)、BADGE（10-6mol/L）预孵育1h后，加入Rosiglitazone预孵育2h，最后加入10-7mol/Ｌ的AngⅡ继续培养24ｈ。�
1.2.3 血管平滑肌增殖的检测 �
采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测各组细胞经不同处理后平滑肌增殖情况。�
1.2.4 免疫细胞化学 �
贴壁细胞经4℃PBS液洗3次，4℃ 4%多聚甲醛固定15min，再以PBS洗3次(5min/次)，0.3% Triton X-100及0.3%H2O2孵育15min，正常二抗血清封闭，分别加兔抗大鼠CTGF（1:400），ColⅢ（1:100）抗体,4℃孵育过夜。次日取出标本经PBS漂洗2次，采用生物素�卵白素�辣根过氧化物酶复合物法显色。�
1.2.5 实时定量PCR �
按照TRIzol 说明书提取106培养细胞总RNA，紫外分光光度计OD 260 nm定量，取1μg总RNA反转录为cDNA。CTGF的扩增引物序列为：上游引物 5��AAGAA GACTC AGCCA GACC�3�，下游引物 5��AGAGG AGGAG CACCA AGG�3�（扩增片段长度260bp）；内参照GAPDH的扩增引物序列为：上游引物 5��GGTCG GTGTG AACGG ATTTG�3�，下游引物 5��GCCTT CTCCA TGGTG GTGAA�3�（扩增片段长度309bp）。在25μl的反应体系中，取SYBR Premix 12.5μl，ROX Reference Dye 0.5μl，上下游引物各10pmol，模板cDNA 1μg，应用ABI PRISM 7000时实定量PCR仪，采用三步法进行PCR反应。反应条件：50℃ 2min，95℃ 2min，（95℃ 15s，59℃ 25s，72℃ 30min）共45个循环。另取不同的模板浓度（1，0.1，0.01）进行PCR反应，分别制定各基因的标准曲线，对各组目的基因作相对定量。并测定各样本PCR反应液的溶解曲线。每样本做3个复管。用ABI prime 7000 SDS软件求出各样本的CT值，再按公式Folds=(C1 /C2)/(C3 /C4)，求出各样本的Folds值（C1：处理样品，待测基因；C2：处理样品，看家基因；C3：对照样品，待测基因；C4：对照样品，看家基因。C1-4根据标准曲线把CT值换为模板原始浓度）。�
1.3 统计学处理：�
实验数据均用 ±SE表示，数据处理采用SPSS10.0统计软件进行方差分析及q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。�
2 结果�
2.1 Rosiglitazone对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响�
MTT结果显示与对照组相比，经AngⅡ10-7mol/L作用24h后，OD492明显增高（P
