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[摘要]目的：探索体外培养组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的条件，并观察其部分生物学活性。方法：采用机械-酶消化法对3周龄新西兰大白兔耳软骨和关节软骨消化来获得软骨细胞，采用全骨髓贴壁法来获得骨髓间充质干细胞，对两种细胞进行原代和传代培养，通过倒置相差显微镜观察细胞形态、绘制生长曲线、免疫组化染色等对细胞进行生物学特性分析。结果：原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主，传代3次以后出现去分化。形态学和免疫组化显示细胞3代以内可以保持表型稳定，具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力，而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别。采用贴壁筛选法获得的BMSCs呈长梭形或多边形，生长曲线呈“S”形，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，细胞生长增殖能力旺盛。结论：体外分离培养的软骨细胞和骨髓间充质干细胞符合组织工程要求，能够作为骨-软骨复合组织的种子细胞。
[关键词]组织工程；骨髓间充质干细胞；软骨细胞；种子细胞
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0748-04
Obtainment and culture of seeding cells of tissue engineered osteochondral composites
LIU Peng1, FU Chong-jian1, DENG Tian-zheng2, JIANG Ming1, LI Ji-guo1, YU Shu-juan1, ZHU Guo-xiong1
(1.Department of Stomatology, Jinan General Military Hospital, Jinan 250031,Shangdong,China;2.Department of Stomatology, General Hospital of the Air Force of PLA)
Abstract: Objective To explore the optimized conditions for isolation and culture of seeding cells of osteochondral composites and observe some biological features of the seeding cells. Methods 3-week-old New Zealand White rabbits were selected for BMSCs and chondrocytes isolation and culture. Articular cartilage cells were obtained by mechanical-collagenase digestion. BMSCs were saparated using whole marrow culture method and purified by attachment method. Morphology and growth characteristics were observed. Results The cultivation of cartilage cells presented with polygonal or triangle, morphology and immunohistochemistry showed that stable phenotype could be maintained within three generations, and the biological characters of chondrocytes from ears or joints were almost the same. BMSCs developed a spindle or polygonal appearance, growth curve was S-shaped, expression of type Ⅱcollagen was positive. Adhesive culture method was proved to be an effective method to provide a large number of BMSCs. Conclusion The chondrocytes and BMSCs are suitable for tissue engineering, and these can be used as seeding cells of osteochondral composites.
Key words: tissue engineering; bone marrow stem cells; chondrocytes; seeding cells
骨-软骨复合组织主要存在于关节、肋骨等区域，尤其是颞下颌关节、膝关节等运动关节，并承担着重要的功能。各种原因导致的关节软骨缺损是常见疾病，由于关节软骨自身修复能力有限，目前无特效治疗方法[1]。近年来组织工程的发展为治疗软骨缺损带来了良好的前景[2]。种子细胞、支架材料和生长因子是组织工程的三大要素，种子细胞的选择是组织工程化骨-软骨复合组织构建的前提。本研究选择了软骨及骨髓来源的细胞，通过对软骨细胞和骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的分离方法、培养条件及生长测定，来建立一种快速、简便、可靠的种子细胞分离培养方法，为下一步实验打下基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物和实验分组
3周龄新西兰大白兔，雄性，体重0.4kg，由济南军区总医院实验动物中心提供。根据取材部位不同分为：耳软骨组（A），关节软骨组（B），BMSCs组（C）。
1.2 兔软骨细胞的分离和培养
动物麻醉处死后，无菌条件下切取双侧耳廓，分离含完整关节的四肢长骨，剥去皮肤及软骨膜，剪成小米粒大小软骨粒，磷酸盐缓冲液（PBS）反复浸泡冲洗两遍，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶消化0.5h，中间吹打一次，用相同体积的胎牛血清中止消化，800r/min离心5min，弃上清，加入两倍体积的Ⅱ型胶原酶37℃恒温摇床消化过夜后，100目筛网过滤，离心，沉淀细胞用PBS洗涤打散2次，以含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺300μg/ml，维生素C50μg/ml，青、链霉素100U/ml的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，计数板计数细胞，台盼蓝染色检查细胞活力，分别以5×106/ml密度（高密度）和1×106/ml密度（低密度）接种于培养瓶中，置37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱内。待细胞贴壁后换液，每2～3天天换液1次，显微镜下观察细胞生长情况情况，当细胞生长汇合成片，约90%融合时，加入0.25%胰蛋白酶进行传代培养。
1.3 兔BMSCs的分离培养：无菌条件下获得的兔股骨和肱骨，用培养液将骨髓腔内骨髓组织完全冲出，置于肝素化的无菌离心管中。在离心管中加入DMEM/F12培养液，混匀制成细胞悬液，1 000r/min离心5min，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，重新混匀，反复洗涤2次，离心后弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，混匀重悬细胞后计数细胞，台盼蓝染色检查细胞活力。细胞以2×106/ml密度接种于培养瓶中，置37℃，5%CO2，饱和湿度培养条件下培养2天进行首次换液，轻轻摇动培养瓶去除未贴壁悬浮细胞。以后每隔2天换液，约7天后细胞可达到近融合状态，待显微镜下观察细胞铺满瓶底约90%时，用胰蛋白酶消化，传代培养。一般选取第三代状态良好的细胞用于实验。
1.4 细胞形态学观察：培养的1代和3代细胞扩增后，在倒置显微镜观察三组细胞的细胞形态变化和细胞外基质形成情况。
1.5 MTT法绘制细胞生长曲线：制备三组细胞悬液，A、B组取第一代细胞、C组取第三代细胞按细胞数2×106/L接种于96孔培养板中，隔日换液，每日测3孔取平均值，连测10天。吸出检测孔培养液，加入5g/L的MTT液20μl/孔，孵育4h，弃去上清液后，加入DMSO 200μl/孔，震荡10min后在酶联检测仪上测吸光度值，波长为490 nm。取细胞数的平均值作为结果，绘制生长曲线。
1.6 Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：取生长良好的第三代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后以1×107/L浓度接种于预置有盖玻片的六孔板中培养。培养3天后，将盖玻片取出放入50g/L多聚甲醛溶液中，固定30min，PBS缓冲液清洗3次，室温下用体种分数10%山羊血清封闭30min以阻断非特异性结合，分别加入鼠抗兔Ⅰ、Ⅱ型胶原单克隆抗体（1:100），4℃孵育过夜。次日，用PBS缓冲液彻底清洗后，加入生物素标记二抗工作液孵育1h，DAB显色，封固，显微镜观察，以不加一抗为阴性对照。
1.7 阿新利蓝检测糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）：分别取每组原代和第三代生长良好的细胞，定量接种6×106个细胞于培养皿中，每周传代一次，留取所有培养液进行检测。吸1ml培养液，加入1.5%阿新利蓝溶液1.5ml，室温放置10min，以硫酸软骨素为标准品，紫外分光光度计比色，根据标准曲线求得样本GAG含量。
1.8 统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据以x±s表示，两组间均数采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，计算总体差异及进行两两比较。
2 结果
2.1 软骨细胞形态：每天相差显微镜下观察，消化出的细胞多为圆形，接种24h后大部分细胞贴壁。细胞贴壁延展后体积增大，逐渐向外伸出伪足，形态多样，大多数为圆形还有少量多角形细胞， 2～3天时长满培养瓶底部逐渐融合成单层。当传至第三代时，细胞逐渐向梭形转变。原代细胞连续培养时可见细胞界限不清，逐渐聚集成团（图1）。如果不传代继续培养1周时，细胞间开始有突起相连，周围有基质样沉积物质。以上形态学变化A、B两组间无显著区别。
2.2 BMSCs的形态：原代细胞接种后，培养物中未贴壁细胞随着换液逐渐被去除，12h后可见有少量细胞贴壁，刚贴壁的细胞多为不规则形或短梭形，之后可见贴壁细胞逐渐增殖，形态也逐渐变为纺锤形或长梭形，1周左右即可传代，传代后细胞生长加快，第三代细胞纯度较高，呈漩涡状生长，状态良好（图2）。平均体外培养扩增10代左右，细胞的传代周期约5～7天，10代后，细胞生长速度减缓，三角形和多角形细胞逐渐增多，呈老化状态。
2.3 细胞增殖率：MTT法测定OD值绘制细胞的生长曲线，结果显示细胞的增殖均呈现 “S”形，第1～4天细胞处于生长潜伏期，第5～8天细胞呈对数生长，大约在第9天达到平台期。三组比较无统计学差异（P＞0.05）。
2.4 Ⅰ、Ⅱ型胶原组织化学染色：各组细胞免疫组化结果显示，A、B组Ⅱ型胶原胞浆及基质阳性（图3、4），Ⅰ型胶原阴性（图5）；C组显示Ⅰ型胶原胞浆阳性（图6），Ⅱ型胶原阴性。
2.5 GAG 含量：各组细胞GAG含量由阿利新蓝法测定，A组（0.3990±0.0067），B组（0.3609±0.0042），C组（0.0907±0.0057）。经统计学分析，A、B组间无显著性差异（P＞0.05），A、B组与C组之间差异有显著性（P＜0.05）。
3 讨论
目前软骨细胞移植成为治疗软骨大面积缺损的主要治疗方法[3-4]。成年动物关节内可用于分离培养的软骨细胞总量较幼年动物少，而且成年动物的关节软骨组织容易存在损伤，所以本实验选用3周龄的新西兰大白兔获取软骨细胞。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，建立良好的机械和化学方法，通过原代培养和传代培养，可分离出较高纯度的软骨细胞。机械分离时，需注意去除干净软骨表面的滑膜组织，尽可能把软骨切细碎。软骨细胞的化学解离主要采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶两步消化法。胰蛋白酶的主要作用是水解细胞间质的蛋白质，Ⅱ型胶原酶的主要作用是分解细胞间Ⅱ型胶原产生的应力，同时结合机械吹打，可以使细胞脱落，也可以使酶和组织块充分地接触，有助于酶对组织块的充分消化。原代细胞贴壁较慢，一般需要24h，其分裂增殖速度较慢，而传代后贴壁和增殖的速度都大为增加，这可能与原代细胞在消化分离时受到一定的机械和化学损害有关。
软骨细胞具有高分化特性，普通单层贴壁培养的软骨细胞在体外难以维持表型，软骨细胞会发生包括形态、表型和相关基因表达的一系列变化，细胞向成纤维细胞转化，从而表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原，丧失表达Ⅱ型胶原和分泌软骨基质的能力[5-6]。在本实验中还发现，三代以内培养的软骨细胞相对稳定，以圆形、类上皮细胞样外形为主，细胞分泌基质形成群体后，变成梭形或多角形，细胞活性高，保持细胞表型，是实验研究的理想细胞。三代以后的细胞逐渐发生去分化，细胞体积增大，出现许多指状突起，胞核增大，细胞增殖速度明显减缓，分泌基质能力下降。在低密度情况下，关节软骨易与基质间失去联系，细胞因子无法提供反馈调节，细胞出现去分化，形态结构发生变化，合成Ⅱ型胶原的能力下降，转化为成纤维细胞样的细胞。高密度培养条件下，五代以内关节软骨细胞均能高表达Ⅱ型胶原和GAG，大多数细胞亦能保持其正常形态，有助于自分泌细胞因子维持其表型和新陈代谢，阻止或减缓细胞的分化。所以在体外培养软骨细胞时，应注意细胞的接种密度。
本实验对兔关节软骨与耳软骨细胞在培养过程中所进行的一系列观察与检测，都没有明显差别，可以认为，兔耳软骨细胞在功能上与关节软骨细胞接近，可以作为关节软骨的替代细胞，这样就可以从原代细胞开始就可以获得更大数量的软骨细胞满足实验需要，同时又避免了对健康关节的损伤。
BMSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞，在不同的诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌腱、脂肪细胞及骨髓基质等多种组织细胞。BMSCs虽具有较强的增殖能力，但在骨髓中的含量很低，因此，如何从贴壁的细胞群中分离纯化BMSCs有着非常重要的意义。目前常用于分离BMSCs的方法有4种：全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠分离法和流式细胞分离法[7]，其中以全骨髓贴壁法和密度梯度离心法最为常用。全骨髓贴壁法操作相对简单，抽取骨髓冲洗后直接接种培养瓶，是根据BMSCs与造血系细胞贴壁性能不同而进行的体外分离纯化方法[8]。BMSCs贴壁快，生长迅速，培养一段时间后，造血系细胞由于不贴壁而死亡或被换液去除。需要注意的是，细胞原代培养时要求无菌操作，在对骨髓腔冲洗时应注意推注压力不宜过高，速度不宜过快，防止冲洗过程中造成细胞因机械应力损伤。密度梯度离心法是利用BMSCs与其他细胞的密度不同，用特定密度的淋巴细胞分离液把BMSCs分离出来，此方法可去除大量的血细胞以及其他骨髓间质细胞，细胞均一性好，便于早期观察和定性细胞研究。全骨髓法细胞贴壁时间较密度梯度离心法早两三天，可能是全骨髓法保留了骨髓环境中丰富的粘附分子和各种生长因子，而且大量不贴壁的血细胞并不影响BMSCs的贴附与增殖，同时血液成分的存在为BMSCs提供了一个稳定的培养环境和营养物质，有利于BMSCs的贴附与增殖[9]。因此，本实验采用了贴壁筛选分离方法，可以最大程度地获取纯化BMSCs。
原代培养的BMSCs一般在24～48h内贴壁，通过换液及PBS冲洗去除悬浮生长的造血系细胞，传代时利用BMSCs较易脱落，其他细胞贴壁性较强的特点，采用消化时间控制纯化BMSCs。原代细胞首次融合时间需要7～10天，本实验所获的BMSCs贴壁能力较强，细胞呈均一的成纤维细胞形态，为梭形、三角形。目前研究没有找到BMSCs的特异性标记物，BMSCs能够表达CD44、CD68、CD77和CD90，而不表达CD34、CD45等造血细胞的特异性标志物。从本实验所培养的细胞形态看，采用全骨髓贴壁法培养纯化的细胞在十代内生长状态稳定，梭形贴壁生长，呈均一的成纤维细胞形态，在对数生长期群体倍增时间约为48h，传代周期约为5～7天。所获得的BMSCs能稳定传代十代以上，说明采用本方法获得的细胞经多次传代后能够纯化，适应能力强，增殖速度快，可以满足一般的实验要求。在体外培养扩增得到大量细胞同时，可见少量BMSCs自动分化。随着细胞传代超过十次以上，BMSCs出现衰老表现。因此，如何保持BMSCs的体外长期增殖和未分化状态仍是干细胞研究的重点和难点。
软骨细胞及BMSCs在体内的增殖和分化受多种因素影响，各因素之间相互形成一个复杂的网络，完全模拟体内作用机制在体外培养细胞，短时间内还难以实现。本实验通过对软骨细胞及BMSCs的获取和传代培养，可以获得大量的目的细胞，这两种细胞作为组织工程骨-软骨复合组织的种子细胞是可行的，为今后进一步进行诱导分化、组织构建及后续的体内移植实验奠定了实验基础。
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[收稿日期]2011-12-10 [修回日期]2012-03-09
编辑/张惠娟
