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【摘 要】目的：建立田七花叶颗粒中人参皂甙Rb1的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(AgilentThermoODSC18柱)，4.6×250mm;流动相：乙腈―0.2%磷酸(32：68);检测波长：203nm;柱温：40℃;流速：1.0ml/min;结果：该方法不受处方中其他成分的干扰，人参皂甙Rb1在104μg/ml～1300μg/ml之间呈良好线性关系。(r=0.999990)，稳定性､重复性良好。平均回收率97.0%，RSD为0.67%。结论：该方法操作方便，准确可靠。可用于测定田七花叶颗粒中人参皂甙Rb1的含量。
【关键词】：高效液相色谱法 田七花叶颗粒 人参皂甙Rb1
【中图分类号】R96;R446【文献标识码】B【文章编号】1007-8517(2008)4-0028-04
田七花叶颗粒收载于《部颁标准》中药成方制剂第二十册[1]，药物成方为三七叶茎花。属解热镇痛､抗炎药。标准未收载[含量测定]项目。参考有关资料[2]，三七叶茎花中含有的主要化学成分是人参皂甙Rb1，人参皂甙Rg1，和三七皂甙R1。作者用高效液相色谱法对田七花叶颗粒中人参皂甙Rb1的含量进行测定，为有效评价田七花叶颗粒的质量提供了方法。
1 仪器及试药
1.仪器 LC―2010A HT高效液相色谱仪､Class-Vp工作站､UV―VIS检测器。UV-265FW紫外可见分光光度计。
1.试剂 人参皂苷Rb1：中国药品生物制品检定所提供，批号为110704-200319，供含量测定用;乙腈：进口色谱纯;磷酸：分析纯;水：乐百氏纯净水;供试样品：田七花叶颗粒14批次。分别是：云南永孜堂药业有限公司(10批次);云南老拨云堂药业､云南植物药业､云南铭鼎药业､昆明中药厂各1批次。
2 方法与结果
2.色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(Agilent Eclipse Thermo ODS C18柱)，4.6×250mm;流动相：乙腈―0.2%磷酸(32：68);检测波长为203nm;柱温：40℃。流速：1.0ml/min。在此条件下，人参皂苷Rb1与其他组分能达到良好分离。
2.提取溶剂选泽 根据人参皂苷Rb1的性质，选用乙醇作为提取溶剂。
2.3 提取方法､时间的比较
提取方法比较了超声处理(功率250W，频率50kHz)20～40分钟及回流提取30分钟，结果表明超声处理30分钟已提取完全，故选用简便､快捷的超声处理30分钟作为前处理方法。见表1。
2.4 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rb1对照品0.2600g，置50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度(5.2mg/ml)，作为贮备液。取储备液1ml于10ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，为对照品溶液(0.52mg/ml)。
2.5 供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，研细(或粉细)过4号筛，混匀，取20g，精密称定，置具锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，密塞，称定重量，摇散，摇匀，超声处理30分钟(每10分钟取出摇散一次)，放冷，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，水浴蒸至近干，加乙醇使溶解，并转移至5ml容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。
2.6 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.7 空白试验 取处方中除三七叶浸膏外辅料，按处方剂量及制法和工艺要求制备缺三七叶浸膏的空白样品，照含量测定项下供试品溶液的制备方法制成阴性对照样品溶液，同法进行测定，结果在与对照品人参皂苷Rb1相同的保留时间位置，无其他干扰峰出现，表明除三七叶浸膏外的其他药材对人参皂苷Rb1峰无干扰。图谱见图1。
2.8 人参皂苷Rb1最大吸收波长的确定 精密吸取上述对照品溶液3ml于50ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度。用UV-265FW紫外可见分光光度计描画人参皂苷Rb1的紫外吸收图谱，可见人参皂苷Rb1在203nm波长处有一显著吸收峰，故我们选择203nm作为人参皂苷Rb1的检测波长，这也与有关文献上所收载报道的一致[2]。
2.9 线性关系与线性范围考察 精密吸取上述对照品贮备液2.0､5.0､10.0､15.0､20.0､25.0､50.0ml，分别置100ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。各注入高效液相色谱仪10ul，按上述色谱条件测定峰面积;以峰面积值为纵坐标，以人参皂苷Rb1进样量(μg)为横坐标作线性回归，绘制标准曲线，得回归方程：Y=181279.48x+4225.25(r=0.999990)，结果表明，人参皂苷Rb1在1.04μg～13μg之间呈良好线性关系。数据见表2，图谱见图2。
2.10 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液10ml，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。各次测得的峰面积值分别是956173､956513､947837､948073､947726､947315，平均值为950606，相对标准偏差RSD为0.47%。
2.1稳定性试验
2.11.对照品溶液稳定性 分别于0､1､2､3､6､12､24小时各进样10μl，按上述色谱条件进行测定。测得其峰面积值分别为956173､947838､948073､947726､947315､948525､949609，平均949323，RSD=0.33%，结果表明，在24小时内对照品溶液中的人参皂苷Rb1是稳定的。
2.11.供试品溶液稳定性 分别于0､1､2､3､9､24小时各进样10μl，按上述色谱条件进行测定。测得其峰面积值分别为1262888､1272395､1339180､1302699､1301102､1299592，平均1296309，RSD=2.1%，结果表明，在24小时内供试品溶液中的人参皂苷Rb1是稳定的。
2.1重复性实验 取批号为20050302的田七花叶颗粒，按正文含量测定方法，分别制备6份供试品溶液，测定人参皂苷Rb1含量，测定结果见表3。
2.13 加样回收率试验 采取全程加样法。取已知含量的样品(批号：200400302，人参皂苷Rb1含量：0.3515mg/g)，分别添加人参皂苷Rb1对照品，按正文中含量测定方法测定人参皂苷Rb1含量，以下式计算回收率，结果见表4。结果表明，本法有较好的回收率。
回收率=(人参皂苷Rb1实测量-样品中人参皂苷Rb1量)/人参皂苷Rb1加入量×100%
2.14 样品的测定 取14批样品，按正文中供试品溶液的制备及含量测定方法测定人参皂苷Rb1含量，结果见表5。图谱见图3。
3 讨论
选泽提取溶剂时，参考了有关文献[2～5]，比较了甲醇和乙醇的试验结果，差异很小，此选用毒性较小的乙醇作为提取溶剂。传统的测定方法都是以梯度洗脱进行测定，我们发现回收率很低(只达到75%)，且受操作过程的影响，RSD很难达到规定。改用不同色谱柱如Kromasil C18､Agilent Thermo ODS C18､Scienhome GEM ODS C18柱比较，结果除保留时间有微小变化外，均能得到较好分离的色谱峰。比较了38℃，42℃与40℃柱温测定结果，柱温改变对峰面积影响较大，故把柱温定为40℃。流动相比例的较小改变(31：69､33：68)对保留时间有微小改变。流速的改变(0.9ml/min､1.1ml/min)对保留时间和峰面积有微小改变。
参考文献
[1]国家药典委员会编，中华人民共和国卫生部《药品标准》中药成方制剂第二十册，1998，81
[2]国家药典委员会编，《中华人民共和国药典》(2005版一部)化学工业出版社，323
[3]苗明三､李振国主编，《现代实用中药质量控制技术》，人民卫生出版社(北京)2000年(第一版)
[4]王宝琴主编，《中成药质量标准及标准物质研究》，中国医药科技出版社，1994年1版。
[5]国家药品监督管理局，《中药新药研究的技术要求》
(收稿日期：2008.1.24)
