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【摘 要】 目的 建立了一种快速简便的副溶血性弧菌的检测方法。方法 将抗副溶血性弧菌多克隆抗体包被到金黄色葡萄球菌Cowan I株上制成SPA菌体试剂,建立协同凝集试验(COA),检测样品中可能的副溶血性弧菌。结果 COA检测的敏感性为2×106 cfu/mL,检测过程为5 min。112份临床标本的测定结果与培养法相比较,COA的特异性、敏感性、诊断符合率分别是100%、94.2%、97.3%。结论 本研究为发展简便、敏感和快速的副溶血性弧菌的协同凝集检测试剂鉴定基础。
【关键词】 副溶血性弧菌;协同凝集试验;检测方法
【Abstract】 Objective To develop a simple and rapid method for detecting Vibrio parahaemolyticus. Methods Staphylococcus aureus Cowan I was coated with anti Vibrio parahaemolyticus polyclonal antibodies and a coagglutination test (COA)detecting Vibrio parahaemolyticus in 112 samples was established. Results The detect limit of COA was 2×106 cfu/mL, and the detect time was 5 min. When 112 samples were tested, the diagnostic specificity, sensitivity and accuracy of the test, compared with standard culture methods,were 100%、94.2%、97.3%,respectively.Conclusion This study lays a foundation for establishing simple and less time-consuming Vibrio parahaemolyticus Coagglutination Test kit.
【Key words】 Vibrio parahaemolyticus;Coagglutination test;Detection method
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是海洋和盐湖中分布广泛的一种嗜盐性病原菌。广泛分布在近海岸的海水、海底沉积物、鱼类、贝类中,适应于高浓度(6%)食盐的环境中生长,在不含食盐的培养基中不能生长。该菌是亚于霍乱弧菌的一种常见肠道致病菌,其污染会给海水养殖业带来严重损失,还会引起人类腹泻等肠道疾病及食物中毒,出现腹泻呈水样或血样便、腹部痉挛、恶心、呕吐和头痛等症状[1-6]。自2001年以来,副溶血性弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患,副溶血性弧菌性食物中毒的起数和人数一直处于第一位。
多数金黄色葡萄球菌的细胞壁内含有一种特殊的蛋白质,称为葡萄球菌A蛋白质(staphylococcal protein A,SPA),SPA的分子量为42 000,等电点为5.1,一个分子内有4个相似的活性部位,能与人及多种哺乳动物(猪、兔、豚鼠等)血清中IgG类抗体的Fc段非特异性结合。IgG的Fc段与SPA结合后,两个Fab段暴露在葡萄球菌菌体表面,仍保持其结合抗原的活性和特异性,当其与特异性抗原相遇时,能出现特异的凝集现象。在此凝集中,金黄色葡萄球菌菌体形成了反应的载体,故称协同凝集试验(coagglutination test)。协同凝集试验可用于微生物的快速诊断、定种及定型,以协助传染病的早期诊断。
本实验应用协同凝集试验建立了副溶血性弧菌的检测方法,为制备副溶血性弧菌的协同凝集检测试剂盒鉴定了基础。
1材料与方法
1.1材料菌株来源:疑似副溶血性弧菌标本92份,取自2007年7～9月间医院就诊病人。按培养检测法接种碱性蛋白胨水37℃增菌鉴定。阳性对照本院检验室提供,菌液浓度为1.3×108 cfu/mL。大肠埃希菌20份,伤寒沙门菌10份由本科细菌室提供。免疫原与反应原:将培养后副溶血性弧菌用0.5%的甲醛PBS配成浓度约10亿/mL的菌液,作为接种家兔用的免疫原,同时也作为试管凝集反应的反应原。动物:体重2 kg以上的雄性健康家兔10只,免疫接种前经检测血清副溶血性弧菌抗体滴度均为阴性。富含SPA的葡萄球菌购自晶美公司。
1.2副溶血性弧菌多抗血清的制备采用睾丸内接种法,双侧睾丸各注射0.5 mL同种免疫原。8只家兔分别用经甲醛处理的4株副溶血性弧菌免疫原,2只家兔用经紫外线处理的1株免疫原进行免疫接种,一次接种后,定期采血检测抗体滴度,观察抗体涨消情况,待抗体滴度明显下降后,进行再次睾丸免疫接种,并观测动物的回忆应答。副溶血性弧菌抗血清滴度测定法:血清从1∶20开始用生理盐水做倍比系列稀释,用试管凝集反应检测血清中副溶血性弧菌的抗体滴度,同时附有各反应原与生理盐水对照,观测结果,出现++以上凝集强度的血清最高稀释度为该血清的抗体滴度。
1.3检测试剂的制备
1.3.1SPA菌体试剂的制备将标准菌株接种于葡萄糖-酵母沁膏-酷蛋白胨琼脂培养基上。37℃培养18～24 h,用无菌的0.01 mol/L,pH 7.2 PBS洗下菌苔,制成均匀悬液。3 000 r/min离心20 min,弃上清。用PBS细菌离心沉淀洗涤2次后,混悬于含0.5%甲醛的PBS内,置于室温3 h。用PBS再离心沉淀洗涤3次后,制成10%细菌悬液(W/V)。置80℃水浴中加热20～30 min。用PBS再次离心沉淀洗涤3次后,制成10% SPA菌体试剂,加入0.1% NaN3,4℃保存。
1.3.2协同凝集试剂的制备取10%SPA菌体悬液1 mL,加和特异性抗血清0.1 mL,充分混匀,放37℃ 1 h,然后置4℃冰箱内过夜。3 000 r/min离心20 min,吸出上清。用0.01 mol/L,pH 7.2 PBS离心沉淀洗涤2次后,配成1%抗体致敏的SPA试剂,4℃保存。
1.4 协同凝集实验的建立在洁净的载玻片上加一小滴生理盐水,加入少量待检细菌制成均匀悬液。加一滴特异性抗体致敏的SPA试剂,充分混合,3 min后观察结果。同时作生理盐水对照及用正常兔血清处理的SPA菌体悬液对照。出现肉眼可见的颗粒状凝集,液体变清者(++)为阳性。5 min后仍无凝集现象者为阴性。生理盐水对照及未致敏SPA菌体对照应为阴性,无自凝现象发生。
2实验结果
2.1VP多抗的鉴定结果BTV多抗鉴定浓度为2.75 mg/mL,ELISA效价为104。
2.2协同凝集实验敏感性检测结果阳性对照用碱性蛋白胨水倍比稀释至2.0×106 cfu/mL时仍出现清晰的凝集颗粒。
2.3协同凝集实验特异性检测结果75份其他肠道杆菌标本,其中大肠埃希菌20份,伤寒沙门菌20份,各取少许菌落接种碱性蛋白胨水37℃增菌6 h,隔水煮沸15 min, 冷至室温后按上法进行检测,结果均为阴性。
2.4协同凝集实验稳定性检测结果将菌体试剂置4℃冰箱1年,其对阳性对照测定的敏感性基本不变。
2.5协同凝集实验与培养法结果的比较112份临床标本,培养法阳性64份,协同凝集法检测,62份阳性,1份阴性,另1份出现非特异性凝集。培养法阴性48份,协同凝集法均阴性。与培养法相比较,协同凝集试验的特异性、敏感性、诊断符合率分别为100%、94.2%、97.3%。
3讨论
本研究从观察睾丸免疫接种后抗体涨消规律入手,探讨此种免疫法快速制备副溶血性弧菌抗血清的可能性,实验结果显示,4株菌分别首次接种的家兔于7～10 d血清抗体滴度达到高峰,与俄国学者在制备伤寒沙门氏抗血清的研究所获得的结果相似。很显然,此法具有操作简易,免疫次数少,节约免疫原,速效等优点,是一个值得推荐的免疫方法。至于睾丸免疫法为何有如此好的结果,其机理有待进一步研究阐明。
除应用甲醛处理的免疫原外,同时还应用了紫外线照射处理的免疫原,以比较二者的免疫效果。曾有学者指出,甲醛处理细菌能破坏其表面的蛋白质构型,损伤免疫原,而紫外线是作用核酸,不损伤细菌蛋白质,所以细菌的免疫原性较强。本实验的结果中,虽经紫外线处理的副溶血性弧菌获得了较好的免疫效果,但由于所用动物太少,是否优于甲醛处理的免疫原,尚需要做更多的试验比较,方能定论。
副溶血性弧菌再次免疫家兔后的抗体主要IgG,SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合的特性,结合后抗体的功能区暴露在葡萄球菌表面,仍然保持与相应抗原特异性结合的特性,且以葡萄球菌为载体,可出现肉眼可见的凝集,该法特异、灵敏、简便、快速,尤其适合海上舰艇人员感染的初步检测。但由于本实验所检测的菌株菌种数较少,且无其他致病弧菌做对照,以及对临床标本的处理等问题仍然需要进一步探讨完善。
参考文献
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(收稿日期:2009-04-14)
