【www.zhangdahai.com--军训心得体会】
（邵阳医学高等专科学校，湖南 邵阳 422000） �� 摘 要：目的：构建维罗纳气单胞菌维管束状纤毛mshB基因突变体。方法：首先根据已知的近缘霍乱弧菌的mshB基因序列，设计PCR引物，扩增并克隆了mshB基因，亚克隆于自杀质粒后，通过同源重组替换野生型mshB基因。结果：经过PCR筛选证实重组质粒已插入细菌的基因组中。结论：成功构维罗纳气单胞菌维管束状纤毛mshB基因突变体，为研究mshB基因在其致病过程中所起的作用奠定了基础。�
关键词：维罗纳气单胞菌（�Aeromonas veronii�）；连接类纤毛（Bfp）；mshB基因 �
中图分类号：R37文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0014-03��
气单胞菌属曾经被分类为弧菌科家族。但现在有了自己的家族叫气单胞菌科。到今天，只发现有七个种类与人类疾病相关，包括：A. hydrophila， A. veronii biovar sobria， A. caviae， A. veronii biovar veronii， A.jandaei， A. schubertii and A. trota (Martin-Carnahan， 2005)。Bfp，取自临床腹泻感染的气单胞菌属种。被纯化后的纤毛属于四型纤毛。目前国内外对维罗纳气单胞菌维管束状纤毛msh基因座研究的很少，仅有少量文献报道。这次对罗纳气单胞菌维管束状纤毛mshB基因突变体的构建对于进一步了解mshB基因功能和机制做了基础性工作。�
1 材料和方法�
1.1 细菌和质粒种类（见表1）
表1 细菌和质粒种类�
1.2 扩增�
引物按照之前Kirov etal �(Kirov and Sanderson，�1996)报道的氨基端序列设计出引物进行测序。�
引物：�
扩增含有mshB基因的PCR片段�
用设计的引物MSHAKF1和MSHAREV，使用Pfx扩增。�
-MSHAKF1�
5’CAATGAAACCAATGGCACTAACAATG 3’�
-MSHAREV�
5’GCAGGCTCATGCATATTGAC 3’�
检测突变体是否成功的片段�
用设计的引物MSHAKF1和BFPREV1，使用Pfx扩增。�
-BFPREV1�
5’CAGAATGATGACGATAACCAG 3’�
1.3 细菌培养基和生长条件�
含有抗甲氧苄啶质粒的E.coli CC118-λpir 用Isosensitest agar，37℃ 隔夜培养。其它所有细菌都在BHIB中37℃ 隔夜培养。80℃冰箱保存。�
1.4 染色体DNA提取�
把临床取得的strain BC88在BHIB中，37℃过夜培养后离心（3，000RPM=1614×g，15min，室温）。上清倒掉，把离心后附在底部的细菌用A溶液混匀，并加入溶菌酶。放入37℃培养30min，接着放入80℃冰箱冷冻10min。加入B溶液后晃动混合物，直到变为清澈。加入RNA酶，然后在37℃培养30min。加入蛋白酶K，37℃培养30min。加入与混合物等量的酚，混合均匀后离心（�13，200�RPM=16100×g，5min，室温），留上清液。反复3次。在上清液中加入醋酸钠和冰乙醇，在20℃保存30min后离心（13，200RPM=16100×g，20min，4℃）。倒掉上清，加入消过毒的纯净水，4℃过夜后放入20℃冰箱备用。�
溶液A溶液B�
-10 mM Tris-HCL， PH7.2-100 mM Tris-HCL， PH8.8�
-150 mM NaCL-1% SDS�
-100 mM EDTA-100 mM NaCL�
1.5 质粒提取�
取少许细菌在10mLBHIB中37℃，摇动培养过夜。然后按照QIAgen提取。�
1.6 酶切和连接�
普通质粒DNA酶切反应用10×缓冲溶液，在合适的温度下，酶切1.5~2.0h，然后用QIAgen PCR column kit提纯。重组质粒DNA酶切后用agarose gel electrophoresis 分离，QIAgen gel extraction kit回收。�
用T4连接酶按照INVITROGEN方法连接。�
1.7 转化�
把重组DNA通过Hanahan方法转入合适的大肠杆菌。把受体细胞和重组混合物混合放在冰上1h，然后42℃热激90s。接着把混合物再次放入冰中1min，加入800 mL BHIB，37℃ 摇动热孵化1h。把转化后的混合物平抹在含有合适抗生素的LBA上进行蓝白选择。�
1.8 受体细胞制作�
大肠杆菌培养到对数生长期后放冰上孵化15min，让后离心（3，000RPM，15min）。弃上清，加入1/3原液体积的RF1溶液并震荡。而后，再次同样条件离心。弃上清，加入4/5原液体积的RF2溶液并震荡。混合溶液放冰上15min。把混合溶液分装入eppendorf管后，瞬间在液氮中冷冻后放入80℃冰箱。�
RF1 (200mL)溶液RF2(100mL)溶液�
-20 mM KCL-1 mM MOPS buffer Ph6.8�
-10 mM MnCL-1 mM KCL�
-6 mM potatssium acetate-7.5 mM CaCL2•2H�2O�
-2 mM CaCL2•2H20-15 mM 100% glycerol�
-30 mM 100% glycerol�
1.9 细胞结合�
把pUC19BK用EcoRI/BamHI酶切后的得到的含有mshB 和 Kmr的片段用klenow 片段和dNTP补成钝性末端。然后连接入被SmaI酶切的自杀质粒pKNG101。把质粒转入E.coli cc118-λpirJ进行抗卡那霉素(Kmr)和抗链霉素(Rifr)双重选择，从而得到质粒pKNG101B。少量E.coli作为质粒供体和BC88混合物在用PBS洗2次后，一同放在100mLPBS中。把混合液点在一个50mm直径的硝化纤维素滤片上。将它们一同放在一个血琼脂上。保持30℃，6h后用1mL PBS洗脱混合物，并稀释10倍。最后用卡那霉素、链霉素和甲氧苄啶进行三重选择。�
2 结果�
图1 mshB基因扩增的的凝胶电泳（8%）分析�
M为DNA ladder。1是mshB基因扩增的产物，其正确的长度是�1.3kb�
图2 质粒pUC19BK的凝胶电泳（8%）分析�
5.4kb的长度表明其是2.7kb的pUC19＋1.3kb mshB基因＋和1.4kb抗卡那霉素基因片段
图3 质粒pKNG101B的凝胶电泳（8%）分析�
1和2是pKNG101B，3是pKNG101。M是supercolid DNA ladder
图4 用引物MSHAF1和BFPREV1在野生型和突变型中同时扩增SmaI酶切位点附近基因的凝胶电泳（8%）分析�
1是野生型长度0.7kb。2，3和4是突变型长度2.1kb。其多出来的1.4kb和插入Kmr的片段长度吻合
3 讨论�
为了研究Bfp蛋白质在Bfp生物合成和相关表现型，在这次实验中我们构建了mshB基因突变体。在将1.3kb的mshB基因的PCR片段连接入被SmaI酶切的pUC19质粒里后，用SmaI/HindIII酶切以确认其连入方向时，发现mshB基因片段以反方向插入质粒中。反复多次，仍是如此。这个现象减缓了研究工作的进度，难以解释。可能是基因的产物对细胞有毒害，其确切原因只能留待以后研究。最后合适的质粒还是做出来了，命名MshB-。�
根据其它近缘细菌中Bfp基因座推测mshB，A，C，D基因被推测属于一个操纵子，并共用一个处于mshB基因上游的启动子。在之前的基因测序过程中，推测在mshB基因和mshA基因之间还有一个启动子。在mshB基因突变体构建出来以后可以做Bfp表达的实验也就是启动子的极性效应来证明这个推测。如果有Bfp表达则可以证明启动子的存在，反之亦然。Bfp是第四型纤毛，被认为很多其它格兰阴性菌最重要的致病因子。其关键功能是可以把细菌粘附在上皮细胞上，也可以帮助有鞭毛的细菌通过坚固表面，也就是颤搐移动。之前的研究表明气单胞菌纤毛与细胞疏水性有关，这也许与mshB基因也有密切关系，可以在这个方面开展研究工作。总之，维罗纳气单胞菌维管束状纤毛mshB基因突变体的构建为研究其在Bfp中的作用起到基础性的意义。�
致谢：感谢邵阳医学专科学校检验系各位老师对我们这次工作的支持。�
参考文献：�
［1］ Bechet，M. ＆Blondeau，R.Aeromonas spp.psssess at least two distinct type4 pilus familiese［J］. Microb Pathogen，2003，23：241-247.�
［2］ Kirov， S. M. ＆ Sanderson， K.Characterization of a type 4 bundle forming pilus from a gastroenteritis-associated strain of Aeromonas veronii biovar sobria［J］. Microb Pathogen， 21， 23-34.Martin-Carnahan， A. (2005) Aeromonas infections，1996.�
［3］ Mattick， J.S.Type 4 Pili and Twitching Motility［J］. Annu. Rev. Microbiol， 2000，56：289-314.�
（责任编辑：王尚勇）
