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文章编号：1009-5519（2008）11-1651-02 中图分类号：R9 文献标识码：A DNA疫苗(DNA vaccine)是1990年从基因治疗(genetic therapy)研究领域发展起来的一种全新疫苗，也称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。DNA疫苗是把含有编码某种抗原蛋白的外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组质粒直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统使外源基因在动物体内表达抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗可激起机体特异性免疫应答，免疫期长，具有生产成本低，易于大规模生产和保存等优点，是具有应用前景的新一代疫苗。但相对于传统疫苗而言，DNA疫苗所激发的免疫反应强度相对较弱，不足以引起足够的免疫保护效果，尤其对人类以及大动物的免疫试验[1]。因此研究DNA疫苗的作用机制、影响因素对该疫苗的发展应用至关重要。
1 DNA疫苗的作用机制
关于DNA疫苗免疫机制，到目前为止还不十分清楚。研究证明，DNA疫苗诱导产生的免疫反应既包含了体液免疫能力(即特异性抗体)，也包含了具有较长记忆时间和细胞杀伤力的细胞免疫反应。一般认为核酸疫苗被导入机体后，被周围的组织细胞(如肌细胞)、抗原递呈细胞(APC)或其他炎性细胞摄取。肌细胞等组织细胞摄取的质粒DNA分子随后在细胞核内转录为mRNA，再被移至细胞质内翻译成抗原蛋白分子。分泌出细胞释放到组织间隙的抗原蛋白分子，被抗原递呈细胞(APC)捕获，加工处理成为抗原肽递呈给T细胞，启动免疫反应。外周淋巴器官的APC也会直接摄取核酸疫苗，表达抗原并递呈给T细胞，触发免疫应答。树突状细胞(dendritic cell)是核酸免疫过程中的最重要抗原递呈细胞，而B细胞不参与核酸免疫过程中的抗原提呈。在引发免疫应答后，细胞毒性T细胞（CTL）应答能够识别表达外源抗原的肌细胞并将其杀伤，导致肌细胞溶解而释放胞内抗原，APC从注射部位直接获取抗原，而启动随后的免疫反应。几条途径的联合作用使DNA疫苗可以通过组织相容性复合物MHC I和MHC II途径激发T淋巴细胞，又能够激活B淋巴细胞。肌细胞等组织细胞在免疫过程中可能起到储存质粒和定期释放的作用[2~4]。
2 DNA疫苗的影响因素
2.1 抗原目的基因的选择：在DNA疫苗的构建中，目的基因通常是选择病原体保护性抗原的编码基因或相关基因，能够诱发机体产生免疫反应。目的基因可以是单个基因、完整的一组基因或编码抗原决定簇的一段或几段核苷酸序列，还可以是来自不同病原体的基因重组连接，但必须确定多个基因产物间的免疫原性不互相干扰。为更好地激发机体的免疫反应，可根据需要对抗原基因进行修饰，使疫苗发挥最大的保护效果。对于易变异的病原体，最好选择核心蛋白保守的DNA序列，这样可应对各种变异的病原体，避免因病原体变异产生的免疫逃避问题。
2.2 载体的选择：对载体的要求是必须能在大肠杆菌中高拷贝地扩增，而在宿主细胞(真核细胞)内则能高效表达且不复制，也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列。用于构建DNA疫苗的载体主要有质粒、细菌或病毒，大多采用质粒作载体。用于构建DNA疫苗的质粒载体及其组件，直接影响质粒DNA的转化或转染效率和外源抗原蛋白在哺乳动物细胞内的表达量，进而影响在免疫机体内诱导的免疫反应，因此应选择高效的哺乳动物细胞表达载体，如 pSV2， pcDNA3.0等。DNA疫苗质粒载体至少包括3个主要的部件：（1）可以在细菌体内复制扩增，得到大量的拷贝；（2）原核生物选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以筛选含有质粒DNA的阳性细菌克隆(菌株)；（3）可在真核生物细胞中表达的强启动子、增强子、选择性标记、终止子、内含子、转录终止序列、polyA等转录调控元件。
3 DNA疫苗的免疫方法
3.1 以质粒为载体的DNA疫苗
3.1.1 直接采用注射、口服或喷鼻等方法吸收质粒DNA：质粒DNA可口服、喷鼻或直接从肌肉、皮下、腹腔、静脉等注射，都取得了不同程度的成功。目前大多数研究者认为[5，6]，横纹肌系统是最有效的摄取外源基因表达蛋白抗原的组织。静脉注射质粒DNA表达载体，可使几乎所有组织发生转染，其中肺、脾外源基因表达率最高。质粒DNA还可以通过口服、滴鼻或喷鼻等方法吸收。Okada等[6]1997年向小鼠鼻内滴注含编码HIV-1抗原的DNA载体，在小鼠体内诱导产生了高水平的免疫反应。此外，Heckert等[7]2002年报道将共表达的质粒与二甲基亚砜以1∶1混合后，涂于鸡翅部皮肤，发现能够诱发局部和全身免疫反应。
3.1.2 基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪将包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。这种方法效率高，免疫应答强烈，但操作复杂，需特殊设备。
3.2 以细菌或病毒为载体的DNA疫苗：细菌或病毒携带法选择一种容易进入某组织器官的细菌或病毒，将其繁殖基因去掉形成繁殖缺陷菌株，然后将质粒DNA转化到该细菌或病毒中，当这些细菌或病毒进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA。如用逆转录病毒、腺病毒等构建非复制型病毒载体，这类载体能有效地向体内转运DNA，但存在病毒感染或致癌的潜在危险，而且由于机体对其产生免疫而导致不能重复使用。
4 DNA疫苗的免疫佐剂
DNA疫苗佐剂根据作用机制主要分为两类：免疫刺激佐剂和疫苗传递体系佐剂。
DNA免疫刺激佐剂主要指能帮助激活固有免疫系统的佐剂，主要包括：（1）细胞因子佐剂。各种细胞因子对机体的免疫应答具有广泛的调节作用，研究发现细胞因子作为疫苗的分子佐剂对各种类型的疫苗都具有不同程度的佐剂效应。细胞因子在体内缓慢而持久地释放，可增强疫苗的保护效果；（2）共刺激分子。T细胞通过其表面的抗原受体来识别抗APC递呈的抗原，然后启动特异性的免疫反应，这个识别过程需要细胞之间的相互接触和细胞表面分子的参与，以稳定和协调细胞之间的相互作用，这些分子就称为共刺激分子。大量研究表明共刺激分子可以作为DNA疫苗的分子佐剂；（3）中药免疫活性多糖。中药多糖一般都有增强机体免疫功能的作用，对正常细胞没有毒副作用。柳仲勋[8]从当归中提取的当归多糖（ASDP)和当归内脂（ASDE3）用作乙型肝炎基因工程苗的佐剂，证明效果明显优于铝佐剂。
DNA疫苗传递体系剂是指能提高DNA疫苗跨膜被细胞吸收利用的佐剂，主要包括：（1）脂质体：脂质体由磷脂或其他极性分子在水相中分散形成。磷脂分子的非极性尾部(烃链)由于疏水而集中于微囊的内侧，磷脂分子的极性头部由于亲水而与水相接触，形成微囊的表面。脂质体具备佐剂和载体功能，类似细胞膜的微球体。Okuda等[9]用阳离子脂质体包裹HIV-1质粒DNA，接种亲代小鼠后发现胚胎组织中有注入的HIV-1质粒，其后代经DNA疫苗免疫后则诱导了更强的免疫应答，表明经HIV-1 DNA接种后的亲代可以把抗原特异性免疫传给其后代。（2）壳聚糖：近些年来，许多研究表明壳聚糖能和DNA形成微囊，可以用做基因转运系统来转运治疗性基因和基因疫苗。1999年Roy等[10]的研究证明壳聚糖－DNA纳米微囊系统能有效地在小鼠小肠释放DNA，诱发有效的黏膜免疫保护反应。2001年McNeela[11]采用壳聚糖和重组的百日咳疫苗同时经鼻腔接种，发现可显著提高针对该抗原的黏膜免疫反应。（3）核定位信号(nuclear localization signals，NLS)：能够入核的高分子蛋白在结构上均存在一个共同特征，即具有一段核定位信号的氨基酸序列。研究发现，部分碱性NLS具有通透生物膜介导外源蛋白质、核酸进行跨膜转运的能力。1999年Zanta等[12]使用从SV40大T肿瘤抗原中分离获得的碱性肽NLS，以转运仅含荧光素酶基因及其CMV的线状DNA，蛋白表达效率比脂质体对照高10～1 000倍。
DNA疫苗的影响因素主要有：抗原目的基因的选择、载体的选择、接种方式、接种剂量和次数、免疫佐剂的使用等方面。提高DNA疫苗效果可通过目的基因选择和修饰或优化密码子，载体的改造和优化，佐剂的选择和使用等来提高DNA疫苗外源基因的入核水平和表达水平。预先给接种部位的肌肉注射蛇毒或局部麻醉剂，可使外源基因表达水平提高[13]。由于DNA疫苗的巨大优势，随着对DNA疫苗的影响因素的深入研究， DNA疫苗将会在传染病预防、肿瘤以及免疫性疾病的治疗中发挥重要作用。
参考文献：
[1] Egan MA，Israel ZR.The use of cytokines and chemokines as genetic adjuvants for plasmid DNA vaccines[J].Ciin Appl Immunol Rev，2002，2：255.
[2] Davis HL，Millan CL，Watkins SC. Immune-mediated destruction of transfected muscle fibersafter direct gene transfer with antigen-ex-pressing plasmid DNA[J].Gene Ther，1997，4：181.
[3] Coombes BK，Mahony JB. Dendritic cell discoveries provide new in-sight into the cellular immunobiology of DNA vaccines[J]. Immunol Letters，2001，78：103.
[4] 邓小玲. DNA疫苗的作用机理以及抗肿瘤的临床应用进展[J]. 国外医学免疫学分册，2005，28（1）:20.
[5] Gregoriadis G. Genetic vaccines: strategies for optimisation[J].Pharm Res，1998，15：661.
[6] Lewis PJ，Babiuk LA.DNA vaccines：a review[J].Adv Virus Res，1999，54：129.
[7] 宋勤叶，杨汉春.核酸疫苗研究进展[J].动物医学进展，2004，25(3)：37.
[8] 王传强，马保臣，秦卓明，等. 疫苗佐剂的研究进展[J]. 家禽科学，2006，7：46.
[9] Okuda K，Xin KQ，Haruki A，et al. Transplacental genetic immuniza-tion after intravenous delivery of plasmid DNA to pregnant mice[J]. J Immunol，2001，167(9)：5478.
[10] Roy K，Mao HQ，Huang SK，et al.Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy[J]. Nat Med，1999，5(4)：387.
[11] McNeela EA，Conner D，Jabbal G，et al.A mucosal vaccine against diphtheria: formulation of cross reacting material (CRM197) of di-phtheria toxin with chitosan enhances local and systemic antibody and Th2 responses following nasal delivery[J]. Vaccine，2001，19(23)：1188.
[12] Zanta MA，Belguise Valladier P，Behr JP. Gene delivery: A single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(1)： 9.
[13] 孙树汉.DNA疫苗[M].上海：第二军医大学出版社，2000.149.
收稿日期：2008-02-20
