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摘要：目的：建立重组人HIF－1α真核表达载体质粒pcDNA3－rhHIF－1α，为进行人HIF－1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究做准备。方法：从人血细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成eDNA。酶切插入pcDNA3载体。结果：获得重组的人HIF－1α真核表达载体质粒pcDNA3－rhHIF－1α，经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，测序插入pcDNA3载体部位正确。结论：重组的人HIF－1α，所选用的pcDNA3可高表达目的基因，为利用其进行人HIF－1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定了基础。
关键词：缺氧诱导因子；载体；质粒
中图分类号：R392.1
文献标识码：A
文章编号：1008－2409(2007)03－0421－03
缺氧诱导因子(HIF)是1992年由Semenza等发现的一种氧依赖转录激活因子，通过与低氧反应元件(HRE)结合，引发下游基因的转录。HIF－1是由α亚基和β亚基组成的异二聚体。HIF－1β为其组成性表达，HIF－1α为其功能性亚基，HIF－1α极不稳定，在常氧条件下，半衰期不到10min，与其降解有关的结构域称为氧依赖的降解结构域(oxygen-dependent degrada-tion domain，ODD)(氨基酸401～603)。本实验的目的是通过分子克隆的方法在体外重组HIF－1α，将ODD结构域删除，使重组的人HIF－1α在正常血氧分压状态下能够在酵母细胞内进行表达，将表达产物免疫小鼠或兔子，提取抗体。检测抗体的中和活性，观察抗体能否减轻模型动物的炎症反应。
1 材料与方法
1．1材料
pcDNA3，pMDl8－T Simple vector(简称T载体)、大肠杆菌JM109、质粒纯化试剂盒、cDNA RT－PCR试剂盒、RNA LAPCR试剂盒、LA Taq PCR试剂盒、Ligation试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR Fragment Recovery试剂盒、BKL试剂盒、工具酶KpnI、XbaI和EcoR V及碱性磷酸酶，DNA marker购自Takara。
1．2目的基因的调取
1．2．1 总RNA的提取采用TRIz 01试剂从血细胞中提取总RNA作为模板，用于RT－PCR。以oligo dT为反转录引物反转录合成cDNA。本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。
1．2．2 引物设计与合成及添加酶切位点 根据缺氧诱导因子－1α的基因序列(Genbank，AF207206)，设计扩增HIF－1α基因片段(第1－390个氨基酸和第786～826个氨基酸)。根据重组要求设计PCR2对引物，第1对上游引物5’GGTACCATG－GAGGGCGCCGGCGGCGC－3’，下游引物 5’．GATAT．CAAGTTTGTCAAAGAGGCTAC－3’，第2对上游引物5，－GATATCATCGATGAAAGTGGATTACC－3’下游引物5’－TCTAGAGTTAACTTGATCCAAAGCTC－3’。在第1对引物的上游引物的5’端加入Kpn I酶切位点，其下游引物和第2对引物的上游引物的5’端均加入EcoR V的酶切位点，第2对引物的下游引物的5’端加入Xba I的酶切位点，引物由Takara公司合成。
1．2．3 目的基因片段的扩增、回收与纯化 以反转录合成的cDNA为模板，分别加入第1对或第2对引物，用PCR仪扩增目的基因片段，扩增条件：94℃预变性l min，98℃变性10s，55℃退火30s和72℃延伸1 min，30个循环之后，1％琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭(EB)染色，通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。两对引物扩增的目的基因片段分别称为A、B片段。
1．3目的基因的克隆
1．3．1建立重组的亚克隆载体50／APCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下切出含有目的片段凝胶，用凝胶回收纯化试剂盒回收并纯化目的基因A、B片段。然后按常规方法进行TA克隆。利用蓝白斑法筛选阳性重组子，挑取单菌落加入3ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200rpm摇床振荡培养过夜，提取质粒，酶切鉴定。
1．3．2 质粒pcDNA3－A的构建 测序正确的目的基因A片段一T载体质粒用限制性核酸内切酶Kpn I和EcoR V双酶切，产物经琼脂凝胶电泳后切胶回收并进行末端平滑及磷酸化。将pcDNA3质粒用EcoR V单酶切，并使用BAP处理，然后使用DNA Ligation试剂盒中的Solution I，将pcDNA3和目的基因A片段连接后，热转化至感受态大肠杆菌JM109细胞中，涂布LB平板，筛选阳性克隆并提取质粒，由Takara完成DNA测序。目的基因片段A克隆进入pcDNA3载体，测序正确的质粒命名为pcDNA3－A。
1．3．3质粒pcDNA3／rhHIF－1α的构建测序正确的目的基因B片段－T载体质粒用Xba I和EcoR V双酶切，电泳分离片段后切胶回收并对末端平滑及磷酸化。将pcDNA3－A质粒用EcoR V单酶切，并使用BAP去磷酸化处理，切胶回收。用So－lution I，将pcDNA3－A与目的基因B片段进行连接，热转化至感受态大肠杆菌JM109细胞中，涂布LB平板，筛选阳性克隆并提取质粒，由Takara完成DNA测序。
2 结果
2．1细胞总RNA提取的鉴定
用TRIz 01试剂提取的血细胞总RNA的质量良好，1％的琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察出现条带及各条带亮度。A260／A280=2.0，1％的琼脂糖电泳鉴定无降解。
2．2重组真核表达质粒pcDNA3的构建和鉴定
通过RT-PCR的方法，用HIF－1α基因特异性引物扩增得到1条2500bp左右的DNA片段(图1)，将其克隆入pMD－T载体，转化JM109细胞，经蓝白斑筛选，取阳性克隆进行扩增。测序结果显示，与Genbank记载的HIF－laeDNA序列完全一致。
2．3重组真核表达载体peDNA3－HIF－1α的鉴定
重组质粒经Kpn I和Xba I双酶切后，电泳得到5.4k和2．5k2个片段，分别与pcDNA3空质粒和HIF－1α eDNA大小一致。而空载质粒经同样的双酶切后仍只有5.4k的单一片段(图2)。以上酶切结果表明，目的基因以正确的方向插入了质粒pcDNA3的多克隆位点。
3 讨论
HIF－1作为一种核转录因子，在哺乳动物的生长发育、生理和病理反应过程中举足轻重。HIF－1活性的调节，可能是治疗很多疾病的切入点。Cramer等发现，HIF－1α不单单是诱导恶性肿瘤新生血管形成的调控因子，它还和髓系细胞介导的机体炎症反应密切相关。他们将髓系细胞系的HIF－1α基因敲除后，能消除小鼠体内出现的炎症。这项发现可能对治疗败血症性休克、关节炎、系统性狼疮和多发性硬化症等自身免疫疾病有作用。对一个发生炎症的个体实行HIF－1α基因敲除是不现实的。故本研究从抗体的角度出发，使用抗体去中和HIF－1α蛋白，达到消除炎症产生的目的。
真核表达载体pcDNA3系列质粒是目前在各种哺乳细胞中能获得高水平蛋白表达的真核表达载体。该载体含有一个位于起始密码子上游的高效翻译增强子，可以明显提高转录效率而增加重组蛋白的产量，为体外大量获得重组HIF－1α蛋白提供了很大的可能性。
本实验利用RT－PCR技术，在体外大量获得编码除氧依赖性降解结构域以外的HIF－1α基因全部功能区的基因片段，然后利用限制性内切酶技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3中，成功地建立了pcDNA3／rhHIF－1α重组真核表达载体。通过建立人源性HIF－1α的真核表达载体，为进一步研究表达出HIF－1α编码的蛋白，并利用该蛋白免疫动物获得抗体。从分子生物学和免疫学的角度探索该抗体抑制机体炎症反应的可能性奠定基础。
[责任编辑 王慧瑾 邓德灵]
