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关键词:细胞培养;实验教学;评价标准 中图分类号: G642.42;R394 文献标识码: B 文章编号: 1008-2409(2009)06-1127-03
细胞培养技术已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术,是生命科学工作者必备的实验 技能。细胞培养的成败受细胞生长的各种条件,个人操作手法、操作环境、使用器具等多种 因素的影响[1]。在多年的教学实践中,笔者发现细胞培养过程一些常见的问题直 接影响到教学的顺利进行,针对这些问题,笔者采取了一些应对措施,取得了较好的效果。
1 细胞培养教学中的一些常见问题
1.1 培养的细胞易 被污染
离体培养的细胞没有抗感染能力,因此防止污染是细胞培养成败的关键。笔者在教 学中发现因各种因素导致学生培养的细胞被污染的比例达30%~40%。
1.2 细胞培养对操作环境要求高,不易组织教学
细胞培养需要在无菌室的超净台中进行,空间较小,教师无法面对大量的学生进行实验示教 ,因此在组织教学上有一定的困难。
1.3 实验过程较长,操作步骤多,不易监控
细胞培养实验的特点是实验的前期准备工作多,实验过程长,操作步骤多。进行一 轮完整的实验,往往需数天时间,而且在实验过程中,学生来做实验的时间不固定,因此教 师不容易对学生的实验全过程进行监控。
1.4 实验评价标准单一,不适于这一类实验的教学
以往对学生细胞培养实验的评价是以学生培养的细胞的生长状况和实验报告为依据,其缺陷 是只注重结果而忽视实验的过程,而学生是否真正掌握细胞培养技术,主要体现在实验的过 程中。
笔者曾在中国科学院生物物理研究所、北京大学医学部、解放军传染病研究所等国内一些重 点实验室学习和进修,虽然细胞培养只是这些实验室最基础的一种技术,但其做细胞培养实 验的一些有益的经验非常值得参考和借鉴。笔者针对在教学中学生经常出现的一些影响实验 教学的问题,综合这些经验,提出了相应的处理对策。
2 应对措施
2.1 完善细胞培养室设施,规范实验操作步骤
2.1.1 细胞培养室应单独隔离出来专用,能建立一定清洁级别的培养室是最好 的,考虑到用于教学的实验室需要较大的面积,可能不易达到这样的清洁级别要求,但至少 要有一个洁净的环境和隔离出一个专用的无菌区[2]。
2.1.2 定期为培养室和超净台消毒,检测细胞培养各种仪器是否正常运转。
2.1.3 超净工作台应保持清洁及宽敞,只放置本次实验用的物品,以利于气流的流通。从外面拿进超净工作台未经灭菌的物品须先用75%酒精擦拭。实验操作 应在台面的中央无菌区域(酒精灯火焰周围直径15~20cm内),不要在边缘及通风口等处操 作。全部实验完毕后,将实验物品带出工作台,用75%酒精擦拭台面后再用紫外线照射30min 。
2.1.4 操作前要按要求洗手,准备已消毒的帽子、口罩、手套、一次性鞋套。 然后更换消过毒的隔离服,通常学生实验由于人数多,难以准备大量的消毒隔离服,可以让 学生换上自己平时实验穿的干净白大衣。对学生强调应注意自身的安全,对于来自人类或病 毒感染的细胞株应特别小心,操作过程中应避免引起悬浮微粒的产生,小心毒性药品,避免 尖锐器的伤害等。操作时动作要准确敏捷,尽量不要说话,打喷嚏或咳嗽应转向背面。
2.1.5 要保证器具和试剂的无菌。所用的各种试剂提前30min从冰箱取出预温。 小心取用无菌的实验物品,任何时候不要用手和吸管接触瓶口,同时开启的容器瓶口之间避 免相互接触。移液用的各种吸管要专管专用,并且要勤换吸管。每次操作只处理一株细胞株 ,即使培养基相同也不共用培养基,以避免混淆或造成细胞之间污染[3]。在教学 中的做法是将所用试剂根据用量分成小包装,不同的实验组各用自己的一套试剂,这样既能 节省试剂,又能控制交叉污染。
2.2 实验示教问题的解决
在解决教师无法面对大量的学生进行实验示教的问题时,笔者采用在实验之前组织 学生观看实验教学录像片,用多媒体示教的方式讲解实验要求,让学生熟悉每一步操作的细 节。与此同时为每实验小组配备一套与实际操作完全一样的实验用具(可以用未经高压灭菌 的器具),模拟进行操作。
2.3 实验过程中的一些细节问题的解决方法
2.3.1 细胞实验的步骤和用 品多 常见到学生做实验时由于准备不充分而导致手忙脚乱,因此实验前的准备非常重要。笔者的 做法是指导学生养成下列习惯:实验前一定要熟悉实验的内容和要求,然后各实验组制作实 验操作小卡片,在卡片上注明本次实验所需要的物品名称、规格、数量(准备的实验器材要 稍多于实际使用数量)、操作步骤及要领、注意事项等。在实验前按照卡片的内容一一清点 实验所需的用品,确认无误以后才进行实验。写有实验步骤、注意事项的卡片可以贴在超净 台外面方便看到的地方,以便随时查看。
2.3.2 超净台中物品摆放不合适 在操作时,由于超净台中物品摆放不合适,导致取用不方便。应提供一个参考的 物品摆放模 式:超净台中常用的物品如废液缸置操作区的右后方,装75%酒精棉球瓶置于左侧,酒精灯 则放在正中央,酒精灯与操作者之间20cm内为主要操作区域,试管架,剪刀,镊子等常备物 品根据个人习惯选择固定的位置放好,以方便取用为原则。
2.3.3 细胞消化不足或过度 这是一个最常见的由非污染引起的细胞培养不好的原因。贴壁细胞在消化传代时,使用相同 的消化酶,即使同一批细胞,各组学生培养的细胞生长状况也不一样,其消化的时间也不尽 相同。有些学生加进消化液后在细胞还没有被充分消化下来时就用吸管反复吹打细胞,结果 是细胞没被吹下来,还造成细胞破碎。有些学生的细胞消化过度,吸弃消化液体时将部分细 胞一起弃去造成损失。笔者的做法是不用统一计时的方法来估计细胞消化的程度,加入消化 液后放在显微镜下观察,待细胞出现分离变圆即终止消化[3]。
2.4 对预防污染反应过度而影响实验的进行
大多数情况下,经过教师的反复强调,学生的无菌意识得到很大的增强。但是常见到学生对 预防污染反应过度,反而造成细胞培养的失败。
2.4.1 将用消毒布包拿进超净台才打开取出 正确的做法是将消毒布包中已消 毒的物品在超净台的外面打开,直接取出放入操作台中,用紫外照射10min,然后启动工作 台的吹风机抽风。
2.4.2 把消毒包中已经消过毒的器械又用75%酒精棉球擦 拭 其实酒精的消毒效果远没有高压好,这样做不仅增加了操作步骤和时间,还有可能带来污染 [4]。
2.4.3 反复烧烤已经高压灭菌的用品 在使用已经高压过的培养瓶 时用酒精灯反复烧烤瓶口,或在操作时将已经吸过细胞培养液、小牛血清等还继续使用的吸 管在酒精灯上反复烧烤。同样增加了不必要的操作步骤,而且残留在吸管内的物质在烧焦后 ,形成对细胞生长有害的碳化物,再取液时带入培养液后会对细胞产生毒害。
2.4.4 灼烧浸泡在75%酒精中的金属器械 浸泡在酒精中的金属器械,在超净台中取出后,用火烧的目的只是为了去除沾在上面的酒精 ,故无须灼烧太久,长时间在火焰上灼烧后,常有学生因使用没有完全冷却的器具而烫伤细 胞[5,6]。
2.5 建立学生自主实验模式及相应实验室管理制度
由于细胞培养实验过程较长,教师不可能时刻跟在每一个实验组后面指导,因此尝试通过建 立学生自主实验模式的途径解决这个问题,具体做法是让学生在观察自己培养的细胞的同时 ,相互检查其他实验组,记录细胞培养状况、实验过程及结果。自主实验模式的建立不仅培 养了学生的自我管理能力,也为以后学生进行设计性、创新性实验打下了基础。健全相应的 实验室管理制度,选择一定数量的学生(如实验小组长)参与实验室管理工作,实验室实施 全天性开放,让学生在做实验时根据需要能随时进入实验室及拿到所需要的实验用品,教师 则可在固定的时间在进行指导。
2.6 建立新的评分体系以解决实验评价标准单一的问题
传统的实验评价标准不适合这一类实验的教学要求,达不到检测是否真正掌握细胞培养技术 的目的。笔者采用对学生进行综合考核评价,着重于学生实验技能与实际操作水平的考核,分别在实验过程中用提问、观察学生的操作以及实验结束后的实验报告、研讨等方式进行考 核,这样的考核贯穿于实验的整个过程中,成绩的评定既注重实验结果更注重过程。
笔者在生物技术专业2002~2006级5届学生中,对这一部分实验内容进行教学改革,通过不断 摸索,取得了一些实施的经验,从教学效果来看,发现这样的教学方式有助于学生掌握实验 技术,学生也乐于接受,同时对其他实验内容的教学也有借鉴意义。
参考 文献:
[1] 锷征.组织养技术[M].北京:人民卫生出版社,1986:1-5.
[2] JOHN R W,MASTERS.Animal Cell Culture [M].Third Edition OXF ORD UNIVERSITY PRESS,2000:2-17.
[3] 费洪新,孙丽慧,张涛,等.人肝癌细胞HepG2细胞培养的体会[J].卫 生职业教育,2007,25(8):138-139.
[4] 司徒镇强,吴军正.细胞培养 [M].西安:世界图书出版社西安公司,2007:11-13.
[5] 张卓然.实用细胞培养技术[M].北京:人民卫生出版社,1999:2-6 .
[6] 王春景,刘玉琴,张宏,等.细胞培养操作中常见问题及处理对策 [J] .基础医学与临床,2009,29(3):335-336.
(收稿日期: 2009-10-12)
[责任编 辑 高莉丽 邓德灵]
