【www.zhangdahai.com--英语演讲稿】
【摘要】 目的 通过对大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的观察，对缺血缺氧造成的脑损伤机制进行探讨。方法 用反转录聚合酶链式反应技术检测大鼠SAH后CVS时海马组织Bcl-2和Bax mRNA的表达变化。结果 Bcl-2 mRNA的表达水平在蛛网膜下腔组1 d时即开始下降，5~7 d时降至最低。Bax mRNA的表达1 d呈上升趋势，5~7 d时达最高。在对照组和假手术组海马组织内的Bcl-2和Bax mRNA的表达水平保持相对恒定。结论 提示Bcl-2 和Bax可能参与了缺血缺氧所致的神经元损伤。�
【关键词】蛛网膜下腔出血；海马；大鼠；Bcl-2；Bax
Rats subarachnoid hemorrhage after cerebral vasospasm in the hippocampus of Bcl-2 and Bax mRNA expression
LIN Lin，LI Dong-song，TAO Chun，et al.Inner Mongolia National University School of Medicine，Inner Mongolia 028000，China
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【Abstract】 Objective Through the rat cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage observation，the hypoxic ischemic brain injury caused by the mechanism discussed.Methods Use reverse transcription-polymerase chain reaction test after SAH CVS rat hippocampus when the Bcl-2 and Bax mRNA expression of.Results Bcl-2 mRNA expression in subarachnoid hemorrhage a day that started to decline,5~7 days to a minimum.Bax mRNA expression of an upward trend，5~7 days to a maximum.In the control group and the sham group within the hippocampus of the Bcl-2 and Bax mRNA expression levels remained relatively constant.Conclusion Bcl-2 and Bax may be involved in the hypoxic ischemic damage caused by the neurons damage.�
【Key words】Subarachnoidhemorrhage； Hippocampus；Rats；Bcl-2；Bax
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蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH），后40%~80%发生迟发性脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)[1]，导致脑缺血和缺氧，严重时发生梗死，成为致死致残的主要原因[2]。本实验采用大鼠枕大池二次注血法建立CVS 动物模型，利用反转录聚合酶链式反应技术动态观察SAH后海马组织内Bcl-2和Bax mRNA的表达变化，并对两者与神经元凋亡的关系及其与SAH后CVS导致缺血性脑损伤的机制进行探讨，为临床上有效防治CVS引起的脑损伤提供思路和依据。�
1 材料与方法�
1．1 动物与分组 健康SD大鼠72只，体质量380~410 g，雌雄不限，由吉林大学实验动物中心提供，动物随机分成9组，正常对照组8只、假手术组32只和SAH组32只，各组根据术后处死时间不同再分为假手术1、3、5、7 d组和SAH 1、3、5、7 d组，每组各8只大鼠。如下分组：1组：正常对照组；2组：假手术对照1 d组；3组：SAH 1 d组；4组：假手术对照3 d组；5组：SAH 3 d组；6组：假手术对照5 d组；7组：SAH 5 d组；8组：假手术对照7 d组； 9组：SAH 7 d组。�
1．2 试剂 由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。�
从基因文库中查到大鼠Bcl-x和Bax基因cDNA序列，应用Oligo 5．0软件程序设计上、下游引物：引物设计：Bcl-2引物：上游5′-CCGGGAGATCGTGATGAAGT-3′；下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3′。Bax引物为：上游5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′；下游5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′。利用上述引物推导的PCR 产物的大小分别为：Bcl-2，376 bp；Bax，284 bp。�
1．3 方法�
1．3．1 模型建立 10%水合氯醛(0．35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠俯卧位固定于操作台上，项部备皮消毒。纵行切开颈部皮肤，暴露枕骨、环椎及环枕膜，用注射器针头刺破环枕膜到达枕大池，有脑脊液流出后，由左眼球后静脉丛抽取0．3 ml无抗凝自体血，以0．1 ml/min注射速度缓慢将0．15 ml/100 g的自体不抗凝血注入枕大池。明胶海绵压迫。将大鼠头低30°俯卧位30 min，以利血液凝固沉积在脑底血管周围。大鼠保温复苏至清醒后自由饮食饮水。48 h后同法操作制成大鼠SAH动物模型。假手术组动物按上述方法在枕大池内注入同样量的生理盐水2次，对照组只做手术不注射。在第2次注射后第1，3、5、7天取脑待检。�
1．3．2 标本取材 各时点大鼠均以10%的水合氯醛(0．35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，经心脏灌流快速灌入生理盐水300~400 ml冲洗，右心房流出颜色鲜亮的液体，4%中性多聚甲醛400 ml灌流，打开颅腔，快速取出海马，-80℃保存。�
1．3．3 组织中总RNA提取 采用TRIzol法提取总RNA。取50~100 mg组织/ml Trigol，加入预冷的Trigol提取液，加入少量液氮充分匀浆，其余步骤严格按提取液说明书进行。所得溶解于无NRnase水中，-80℃保存。�
1．3．4 逆转录反应 合成第一链cDNA具体反应体系为：①在40 μl的反应体积中总RNA 5 μg；②加入5×缓冲液Bufter 8 μl；③dNTPmixyure 10 ml/U，2 μl；④digo（dT）18，2 μl；⑤AMU 0．5 μl；⑥DEPC水补充到50 μl。置室温10 min，42℃水育1 h，冰水冷却2 min，合成cDNA，-20℃保存。�
1．3．5 PCR扩增 合成的cDNA进行PCR扩增，步骤：①在25 μl反应体积中加入cDNA 0．1 μg；②10×PCR 缓冲液（Bufter）2．5 μl；③dNTPmixyure 10 ml/U，2 μl，DNA聚合酶（Takara）2．5 μl；④MgCl�2 2．5 μl；⑤各引物0．5 μl；循环条件：93℃、30 s，55℃、72℃ 1 min，30 s，33个循环。�
1．3．6 Bcl-2、Bax的表达 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统进行照相扫描并进行密度分析。�
1．3．7 统计学方法 用Labworks 软件对各阳性条带的密度进行测量，测得的Bcl-2和Bax 阳性条带的密度作为其mRNA的表达量。采用SPSS软件作方差分析，以P0．05）；②SAH组：在SAH 后1 d Bax mRNA的表达不明显，3 d Bax mRNA的表达开始明显升高（P0．05）；②SAH组Bcl-2 mRNA的表达水平：1 d开始有呈下降趋势，3 d时即有明显降低，5 d时降至更低，7 d时最低，与正常对照组及同时间点的假手术组相比差异有统计学意义（P[3]。研究表明，Bax的过度表达及Bcl-2表达的相对不足是导致SAH后细胞凋亡即造成神经损伤的重要环节[4]，细胞凋亡减弱时Bcl-2表达增强，反之凋亡增强时Bcl-2表达减弱而Bax增强[5]。有人认为[6]，Bcl-2抑制细胞凋亡作用是与其形成异源二聚体有关，Bcl-2高表达时，其形成异源二聚体Bcl-2/Bax而抑制调亡，Bax亦是通过与线粒体上Bcl-2蛋白形成二聚体发挥作用，Bax高表达时其形成同源二聚体Bax/Bax而诱导凋亡。Bax与Bcl-2的相对比值在决定细胞生存或死亡中也可能起关键性的作用，但它在细胞凋亡过程中发挥怎样的作用还不太清楚[7]。由于海马区神经元对缺血具有选择性敏感，所以海马成为缺血性脑损伤研究的一个典型脑区[8]。笔者用枕大池二次注血法建立的SAH大鼠脑血管痉挛模型上，笔者观察到SAH组动物海马内Bcl-2和Bax mRNA的表达变化，在SAH发生后的1 d，Bcl-2 mRNA的表达开始出现降低趋势，3 d明显降低，5~7 d降低到最低水平；而Bax mRNA在SAH组表达随SAH时间的延长呈现增高，1 d组只有轻微表达，3 d组开始明显表达，5~7 d时最高，表明在SAH组脑缺血后海马神经元中凋亡抑制因子Bcl-2的表达受到抑制和凋亡促进因子Bax的表达增强，Bcl-2和bax的比值发生了转变，这一表达和比值的改变可能促进了海马神经元的凋亡[9]，这可能是SAH 后CVS 造成缺血性脑损伤的机制之一。�
从本实验结果还可以看出，海马内Bcl-2和BaxmRNA的表达变化最早出现在SAH发生后的1 d，提示SAH 后CVS 导致的海马神经元的损伤在早期即可发生，3~7 d损伤严重，这一结果和临床报导一致[10-11]，有人发现丙戊酸钠可诱导Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，使Bcl-2与Bax的比值增大，发挥抗细胞凋亡作用[12]。然而，SAH后CVS的神经损伤机制和环节非常复杂，相关措施应用于临床发挥治疗作用尚需进一步研究和证实。但可以预见，从分子和基因水平干预SAH后CVS的损伤过程，减少神经元凋亡，将会给临床治疗带来希望。�
参 考 文 献�
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