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【摘要】 目的 分析钛颗粒刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子在人工髋关节术后引起骨溶解而假体松动的分子生物学机制。方法 采用钛颗粒刺激巨噬细胞而释放TNF-α模型及酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹、凝胶迁移率实验方法来研究其生物分子学机制。结果 鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α，而JNK抑制剂 SP600125和 NF-κB抑制剂MG132 明显抑制了钛颗粒诱导的TNF-α释放，但p38抑制剂无此作用，甚至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1 和 NF-κB。结论 钛颗粒诱导的TNF-α释放与JNK/AP-1及NF-κB通路有关。�
【关键词】人工髋关节置换术；钛颗粒；骨溶解; 肿瘤坏死因子
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The effect of TNF-α release in macrophages stimulated with titanium particles on the aseptic loosening of artificial joints
JIN Shan.Yanbian the Second People’s Hospital,Jilin133001，China
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【Abstract】 Objective To analyse the mechanism ofosteolysis after total hip replacement by tumor necrosis factor-α(TNF-α)release in macrophages stimulated with particles.Methods A model of TNF-α release by stimulating macrophages with titanium particles was made and study the mechanism of TNF-α release by ELISA/West blot/EMSA.Results TNF-α was released in murine macrophage stimulaged by titanium(Ti)particles and specific inhibitors of JNK(SP600125)and NF-κB(MG132),but not p38(SB203580)dramatically inhibited Ti-stimulated TNF-α release.Moreover,transcriptional activation of AP-1 and NF-κB was also induced by Ti particles.Conclusion These results demonstrate that Ti particle-induced TNF-α release is mediated through JNK/AP-1 as well as NF-κB pathways.�
【Key words】THR; Ti particles; osteolysis; TNF-α
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人工髋关节置换术后假体周围的骨溶解而引起的假体松动是人工关节术后失败的常见原因。由于假体长时间磨损及腐蚀生成的颗粒碎片，导致假体周围形成肉芽肿假膜，这些假膜组织包含的巨噬细胞、纤维母细胞、巨细胞及破骨细胞等[1-2]受颗粒碎片刺激而产生有关骨溶解及假体松动的炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-11及转化生长因子-β[3-4]的相互作用，使破骨细胞被激活而吸收骨组织，导致骨溶解及假体松动。�
在这些炎症因子中，TNF-α是很重要的骨溶解因子。Kimble 等已证明TNF-α可以增强成骨细胞NF-κB配位子(RANKLE)受体及巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)受体活性[5]。而且，Ingham 等发现TNF-α又直接促进前破骨细胞分化并激活成熟的破骨细胞吸收骨组织[6]。与此同时,Merkel 等通过去除肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因的动物颅骨与PMMA 颗粒接触，发现无骨溶解现象[7]。这些结果显示，TNF-α是人工关节术后磨损颗粒导致的骨溶解重要细胞因子。但至今,尚未报告与此相关的分子生物学机制。本次实验,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α模型来分析TNF-α合成的分子生物学机制。�
1 材料与方法�
1．1 材料�
1．1．1 DMEM培养基，牛胎血清(FBS)来自于Gibco Invitrogen 公司(Rockville,MD)。PD98059、SP600125、MG132 来自于Calbiochem公司(La Jola,CA)，抗磷酸-ERK /JNK/IkBα 抗体来自于Cell Signaling Technology公司(Beverly,MA)。测定鼠TNF-αELISA 试剂盒来自于BioSource international公司(Madison,WI)。EGCG 来自于Sigma(St.Louis,MO)。硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于Amershan Biosciences 公司(Piscataway,NJ)，其余化学试剂来自于Sigma。�
1．1．2 细胞培养 RAW 264．7 细胞培养在由10%FBS及1%青链霉素添加的DMEM 培养基以及5％CO2湿润的37℃空气中，等生长到60%~70%后计数并培养在96孔培养皿(2×10�4个细胞/孔)或60 mm 组织培养皿(2×10�6 个细胞/皿)，然后，细胞与已知浓度的PD98059、SP600125、MG132处理30 min后，再与钛颗粒处理。上清液及细胞收集后用于进一步分析。�
1．1．3 钛颗粒准备 钛颗粒(1~3 μm)来自于 Cerac公司(Milwaukee,WI)，颗粒用25％硝酸及95％乙醇、0．1 N氢氧化钠混合液消毒。颗粒内毒素由Limulus Amebocyte Lysate 方法(Biowhittaker,Walkersville,MD)测定。�
1．2 方法�
1．2．1 ELISA(酶联免疫吸附剂测定) RAW 264．7细胞(2×10�4/孔)在PD98059/SP600125/MG132 等抑制剂添加或不添加的情况下用钛颗粒处理。TNF-α 用ELISA 方法来测定。具体如下：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100 μl/孔，4℃放置24~48 h。洗涤液冲洗ELISA板3次，加待测样品、阴性对照及稀释的标准品，100 μl/孔，37℃，1 h。标准品稀释方法：取标准品，溶于100 μl标准品稀释液中做1:100稀释为10 ng/ml以后再稀释至78 pg/ml，即：10、5 、2．5、1．25 ng/ml、625、312 、156、78 pg/ml。洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100 μl/孔，37℃，1 h。洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100 μl/孔，室温或37℃显色15~30 min。ELISA读数仪测450 nm/650 nm处OD值，绘制标准曲线。�
1．2．2 Western blot(蛋白质印迹) 将RAW 264．7细胞用钛颗粒处理后，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0．5％去氧胆酸及50 mmol/L Tris-HCl,pH 8．0)中，室温下1 h，离心10 min(13 000转/min)，取上清液，检测蛋白浓度。将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3 min，分别加入4%~15% 十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45~60 min(电压200 V)。将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜，在90 V电压下转移1 h，将其置于5%无脂牛奶中1 h(去除非特异性染色)后取出，加第1抗体-ERK/JNK/IkBa(抗体稀释液：1%小牛血清、Tris盐溶液、0．5％ Tween 20)于硝酸纤维膜，4℃过夜，漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体，再置室温1 h，漂洗3次，用放射自显影法显影，Kodak X胶片摄影。Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较。�
1．2．3 EMSA(凝胶迁移率实验) 准备细胞核提取液[8]。蛋白浓度用BCA试剂盒测定。凝胶迁移测定方法按Promega 公司说明书进行。7 μg 核抽提液与1 μg poly d(I-C)含50 000~100 000 cpm 32P标记的AP-1/NF-κB置25 μg的结合缓冲液(10 mM Tris-HCl,pH 7．5,100 mM NaCl,1 mM DTT,和4%甘油)于室温30 min，形成的复合物在0．5×TBE缓冲液(50 mM Tris-HCl,pH 8．5,50 mM硼酸,和1 mM EDTA)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并凝胶在真空中变干60 min后 X 胶片摄影。�
1．2．4 统计学方法 统计分析用SPSS 11．0并完全随机设计的单因素方差分析。P[9] 。为确定钛颗粒诱导的TNF-α 释放与AP-1/NF-κB活化有无相关，RAW264．7细胞受钛颗粒处理并EMSA 方法测定。由钛颗粒刺激15 min及30 min 后，明显活化AP-1/NF-κB(图5)。总之，这些结果表明钛颗粒诱导的TNF-α释放与调节下降与JNK/AP-1及NF-κB活性有关。�
图1 RAW264．7细胞受钛颗粒刺激后钛浓度依赖性TNF-a 释放
注：与对照组0比较，��**�P[10-11]，因此，它的合成将成为阻止颗粒诱导的骨溶解可能性目标。�
对受各种刺激而释放TNF-α已有很多研究。本研究中，证明RAW264．7巨噬细胞株受钛颗粒刺激后呈剂量及时间依赖性释放TNF-α(图1)。在TNF-α 启动因子中包含AP-1/Ets/NFAT等不同的转录因子潜在的结合位。这些转录因子对TNF-α 基因活化起重要作用[12] 。其中，NF-κB是诱导TNF-α 研究较多的转录因子之一[13-14] 。而AP-1或其他转录因子可能与TNF-α 表现有关[15]。实际上，RAW264．7细胞受钛颗粒刺激后诱导JNK/ERK及IkB降解等信号分子活性(图4)。与此结果相似，JNK及NF-κB药物性抑制剂相当程度上减少钛颗粒刺激而释放的TNF-α(图3)。然而，笔者认为JNK 磷酸化Jun 后活化AP-1是RAW264．7细胞受钛颗粒刺 激而活化的(图4)。因此，笔者试图是否RAW264．7细胞受钛颗粒刺激后AP-1被激活。与笔者预期一样，AP-1 被钛颗粒迅速激活,而且,同时激活NF-kB(图5)。由此，笔者可以肯定RAW354．7细胞受钛颗粒刺激产生TNF-α与JNK/AP-1及NF-kB通路有关。�
4 结论�
此项研究首次证明了钛颗粒诱导的TNF-α 释放不仅NF-κB通路有关,而且与JNK/AP-1通路有关。因此，笔者认为阻止这些通路将对人工髋关节置换术后产生的骨溶解及假体松动具有预防及治疗作用。�
参考文献
［1］ Archibeck,M.J,J.J.Jacobs,K.A.Roebuck,et al.The basic science of periprosthetic osteolysis.Instr Course Lect，2001，50:185-195.�
［2］ Mirra,J.M.,R.A.Marder,H.C.Amstutz.The pathology of failed total joint arthroplasty.Clin Orthop Relat Res，1982：175-183.�
［3］ Al-Saffar,N,H.A.Khwaja Y.Kadoya,et al.Assessment of the role of GM-CSF in the cellular transformation and the development of erosive lesions around orthopaedic implants.Am J Clin Pathol，1996，105:628-639.�
［4］ Kim,K.J.,H.E.Rubash,S.C.Wilson,et al.A histologic and biochemical comparison of the interface tissues in cementless and cemented hip prostheses.Clin Orthop Relat Res，1993,142-152.�
［5］ Kimble,R.B.,S.Srivastava,F.P.Ross,et al.Estrogen deficiency increases the ability of stromal cells to support murine osteoclastogenesis via an interleukin-1and tumor necrosis factor-mediated stimulation of macrophage colony-stimulating factor production.J Biol Chem，1996，271:28890-28897.［6］ Ingham E.,J.Fisher.The role of macrophages in osteolysis of total joint replacement.Biomaterials，2005，26:1271-1286.�
［7］ Merkel,K.D.,J.M.Erdmann,K.P.McHugh,et al.Tumor necrosis factor-alpha mediates orthopedic implant osteolysis.Am J Pathol，1999，154:203-210.�
［8］ Park E.K.,M.S.Kim,S.H.Lee,et al.Furosin,an ellagitannin,suppresses RANKL-induced osteoclast differentiation and function through inhibition of MAP kinase activation and actin ring formation.Biochem Biophys Res Commun,2004,325:1472-1480.�
［9］ David,J.P.,K.Sabapathy,O.Hoffmann,et al.JNK1 modulates osteoclastogenesis through both c-Jun phosphorylation-dependent and-independent mechanisms.Journal of Cell Science,2002,115:4317-4325.�
［10］ Algan,S.M.,M.Purdon, S.M.Horowitz.Role of tumor necrosis factor alpha in particulate-induced bone resorption.J Orthop Res,1996,14:30-35.�
［11］ Schwarz E.M.,E.B.Benz,A.P.Lu,et al.Quantitative small-animal surrogate to evaluate drug efficacy in preventing wear debris-induced osteolysis.J Orthop Res,2000,18:849-855.�
［12］ Newell,C.,A.Deisseroth,G.Lopez-Berestein.Interaction of nuclear proteins with an AP-1/CRE-like promoter sequence in the human TNF-alpha gene.J Leukoc Biol,1994,56:27-35.�
［13］ Kuprash D.V.,I.A.Udalova,R.L.Turetskaya,et al.Similarities and differences between human and murine TNF promoters in their response to lipopolysaccharide.J Immunol,1999,162:4045-4052.�
［14］ Schwarz E.M.,A.P.Lu,J.J.Goater,et al.Tumor necrosis factor-alpha/nuclear transcription factor-kappaB signaling in periprosthetic osteolysis.J Orthop Res,2000b,18:472-480.�
［15］ Diaz B.,G.Lopez-Berestein.A distinct element involved in lipopolysaccharide activation of the tumor necrosis factor-alpha promoter in monocytes.J Interferon Cytokine Res,2000,20:741-748.�
