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【摘要】目的:探讨盐酸法舒地尔(Fasudil hydrochloride)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脑中Rho激酶-Ⅱ(ROCK-Ⅱ)表达的影响。方法:雌性C57BL/6小鼠,分为EAE组、治疗组和佐剂组。用MOG35-55多肽诱导EAE模型。治疗组于d6p.i.开始腹腔注射盐酸法舒地尔液,连续14天。观察和比较各组临床表现,于d18-20p.i.取脊髓和脑,行HE染色、Western blot法检测各组ROCK-II的表达。结果:盐酸法舒地尔能够显著改善EAE的症状,减轻中枢神经系统(CNS)炎性浸润等病理变化。各组小鼠脑中均有ROCK-Ⅱ的表达,EAE组ROCK-Ⅱ表达量较佐剂组要高(P 1.2.2 EAE模型的制备及神经功能评分。MOG33-35稀释液与等量含结核杆菌(TB)的CFA混合,制作抗原乳剂,按0.1ml/只给于EAE组和治疗组小鼠脊柱背侧皮下注射,佐剂组以生理盐水代替MOG33-35稀释液制成乳剂同法注射,记免疫后(p.i.)当日为d0p.i.,各组小鼠于d0p.i和d2p.i.分别给予百日咳毒素(PTX)700ng/只/次,作为免疫增强剂。治疗组于d6p.i.开始给予腹腔注射盐酸法舒地尔液(50mg/kg d),连续治疗14天。同时,EAE组和佐剂组给予同等剂量生理盐水。
采用国际通用的5分评分制对小鼠进行临床评分:0分:无任何临床症状;1分:尾部张力消失,可见轻度步态笨拙;2分:一侧后下肢无力,被动翻身后可以恢复;3分:双后肢瘫痪,被动翻身后不能恢复,但给予刺激后可以挪动;4分:双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪;5分:濒死状态或死亡。症状介于两者标准之间者以±0.5计。
1.2.3标本采集。于d18-20p.i,各组随机取8只动物,麻醉后心脏灌流,快速冰上解剖脑组织,4%多聚甲醛继续灌流,分离脊髓,制作石蜡切片,行HE染色。脑组织匀浆后提取蛋白,做Western blot检测。
1.2.4 组织学观察。组织脱蜡至水;苏木精染色15min;自来水洗20s;1%盐酸-酒精分化5~10s;自来水返蓝1~2min;伊红染色1min;自来水洗20s;梯度酒精脱水各5min;二甲苯透明2次,各10min;中性树胶封片,光镜下观察。
1.2.5 小鼠脑中ROCK-II蛋白的检测。组织匀浆,提取蛋白;BCA蛋白定量,配制胶液并灌胶;SDS-10%PAGE电泳分离;转膜,染色并照相,经TBST洗涤脱色;封闭2h;TBST洗涤4次;加一抗稀释液4℃摇育过夜;TBST洗涤洗膜;加HRP标记的二抗稀释液室温摇育1.5h;TBST洗膜;用化学发光法显色;将所得谱带照相并经图像分析软件分析相应谱带密度值。
1.2.6 统计学处理:数据均采用均数±标准差(x-±s)来表示,采用SPSS13.0软件对所得数据进行分析处理。组间临床症状评分比较采用秩和检验,其余组间比较采用单因素方差分析,率的比较采用χ2检验,P
