【www.zhangdahai.com--个人工作计划】
【摘要】目的:研究胃肠道癌肿患者外周血CD4+CD25+FOXP3+调节性T(Treg)细胞的表达,并探讨其临床意义。方法:通过免疫荧光术及流式细胞仪检测20例胃癌患者及20例结肠癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞、CD4+CD25+high�Treg细胞、CD4+T细胞及CD4+CTLA-4+T细胞。结果:胃癌组、结肠癌组与健康献血者比较外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞、CD4+CD25+high�Treg细胞及CD4+CTLA-4+T细胞显著增多,CD4+T细胞显著减少;胃癌、结肠癌患者之间其外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞、CD4+CD25+high�Treg细胞、CD4+T细胞及CD4+CTLA-4+T细胞无显著差异。结论:胃肠道癌肿患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞显著高于健康献血者,这可能与胃肠道癌肿患者的免疫抑制和肿瘤的进展相关。
【关键词】胃癌 结肠癌;CD4+CD25+FOXP3+Treg;CD4+;CD25+high�Treg CD4+T;CD4+CTLA-4+T
Peripheral regulatory CD4+CD25+FOXP3+ T cells in patients with gastrointestinal m alignancies
Chou Jun-Lan,Zhang Hui,Zhao Feng-lin,Cao Fei,Wu Huilian ,FENG Lin
(Municipal Hospital, Suzhou, Jiangsu, Suzhou,215000)
【Abstract】 Objects: To demonstrate the possible involvement of CD4+CD25+FOXP3+ �regulatory T(Treg)cells in immune system impairment in patients with gastrotestinal m alignancies. METHODS: The CD4+CD25+FOXP3+Treg cells、CD4+CD25+high�Treg cells、CD4+Tcells and CD4+CTLA-4+T cellswere analyzed in peripheral blood in 20 patients with gastric cancer,20 patients with colon cancer by flow and immunofluorescence. RESULTS: Compared with healthy controls, patients with gastric cancer and colon cancer had higher percentage of CD4+CD25+FOXP3+Treg cells、CD4+CD25+high�Treg cells and CD4+CTLA-4+T cells,had lower percentage of CD4+Tcells.There were no significant differences between healthy volunteers and patients with gastric cancer or colon cancer. CONCLUSIONS: The increased percent of CD4+CD25+FOXP3+Treg cells may be related to immunosuppression and tumor progression in patients with gastrointestinal m alignancies.
【Keywords】CD4+;CD25+high�Treg CD4+T;CD4+CTLA-4+T
在我国,相对身体其它系统而言,消化道癌肿的发病率居于首位。CD4+CD25+Treg细胞来源于胸腺,是免疫系统维持免疫稳态的重要组成成分,具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特点,通过直接的效应细胞之间的相互接触方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖,其在肿瘤免疫及自身免疫的调节中起重要作用。本研究采用流式细胞仪测定了胃、结肠癌患者的外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞、CD4+CD25+high�Treg细胞、CD4+T细胞、和CD4+CTLA-4+T细胞,以探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1材料研究对象 包括从2006年1月至2007年12月来我科接受化疗的20例胃癌患者(男13例,女7例,年龄51.3岁)和20例肠癌患者(男12例,女8例,年龄58岁),入组患者均经手术病理确诊,术后已接受多次化疗,且均无近期感染和自身免疫病史,另收集来体检中心体检的29例年龄性别配对的正常人作为对照组。胃肠癌及正常对照组均于空腹状态下抽取静脉血3 ml,置于EDTA抗凝管,待检。
1.2研究方法
1.2.1主要仪器与试剂美国BD公司FACS流式细胞仪,K2EDTA真空采血管,溶血素(FACSLysingSolution),CD4+CD25+high�Treg细胞鉴定采用藻红蛋白(PE)结合的CD25-PE单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD4-FITC单克隆抗体、叶绿素蛋白复合物(PerCP)结合的CTLA-4PerCP,APC- Foxp3配套试剂,阴性对照为鼠IgG1-PE,IgG1-FITC, IgG1-APC;上述试剂均为美国BD公司产品。
1.2.2CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞、CD4+CD25+high�Treg细胞、CD4+T细胞、和CD4+CTLA-4+T细胞的检测取全血100(l,分别加入荧光标记的单克隆抗体CD25-PE、CD4-FITC、CTLA-4PerCP各10(l,室温避光孵育15-20min,加十倍稀释的溶血素2ml避光10 min,离心1300人r/min,5分钟。弃上清,加入1ml稀释好的破膜细胞固定液(破膜细胞固定液原液与破膜细胞固定稀释液1:3稀释),室温固定30min,加破膜缓冲液2ml,洗涤2次,然后加入特异性的APC标记的抗FOXP3+单克隆抗体,4��0�C闭光反应50 min,再加入2ml破膜缓冲液,洗涤2次,300(l破膜缓冲液重悬细胞,应用流式细胞仪检测,结果以FOXP3+阳性细胞占CD4+CD25+Treg细胞的百分率表示。同时,获取CD4+CD25+high �Treg细胞、CD4+T细胞和CD4+CTLA-4+T细胞。
1.2.3流式细胞术检测分析用CaliBRITE beads 校正FACSCalibur 流式细胞仪,调用Cellquest 软件。检测同型对照管,以FSC - SSC 散点图设淋巴细胞门,分别建立IgG1 - FITC 对IgG1 - Percp、IgG1 - FITC 对IgG1 - APC、IgG1 - PE 对IgG1 -FITC散点图,分别建立十字象限门,使98 %～99 %的细胞位于左下象限;然后检测样本管,读取数据。
1.3 统计学处理所测资料应用SPSS12.0统计软件分析,两组均数进行方差齐性检验后,采用T检验。P0.05)。
+Treg细胞、CD4+CD25+high �Treg细胞、CD4+T细胞和
CD4+CTLA-4+T细胞
组别nFOXP�3�+CD4�+CD25+highCD4�+TCD�4�+CTLA-4�+T对照组292.65±0.6381.60±0.47 40.42±5.861.13±0.29胃癌206.20±2.751.99±0.5035.60±5.831.73±0.63 结肠癌 206.08±1.772.12±1.04 33.85±8.032.04±1.53P值[1,2],机体可以通过CD4+CD25+Treg细胞以“主动”方式维持自身免疫耐受,在外周免疫耐受机制中发挥着十分重要的作用。本文发现:胃肠道癌肿患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞显著增多(P均[3] 。CTLA-4亦可与CD80和CD86结合,转导T细胞活化的抑制信号,从而抑制T细胞的活化、增值及免疫效应[4]。本文发现:胃肠道癌肿患者外周血CD4+CTLA-4+T细胞亦显著上升(P均[5,6]。胸腺内FOXP3 mRNA 仅在CD4+CD25+CD8 ��-� 胸腺细胞被检测到,而在CD4+CD25��-�CD8 ��-�细胞、CD8+CD4��-� 细胞和其它未成熟的胸腺细胞中并未发现。在B 细胞和CD8+ 的细胞中也未检测到FOXP3 的表达[6] 。FOXP3的表达和CD4+CD25+Treg细胞数量并不一定相关,有可能存在差异。因此,在评价治疗肿瘤和自身免疫性疾病的效果时,观察CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞数量的高低,可能比检测CD4+CD25+Treg细胞更有意义[7,8] 。鉴于CD25 可非特异性的表达于活化的T 淋巴细胞表面, 因而外周血中CD4+CD25+T细胞并非全为CD4+CD25+Treg 细胞,并且具有免疫调节或抑制活性的细胞主要是高表达CD25+ �的CD4+T细胞即CD4+CD25+high�Treg细胞[9] �。本文发现:胃肠道癌肿患者外周血CD4+CD25+high �Treg细胞亦高于健康献血者(P均
