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【摘要】目的:探讨木瓜提取物的抗炎、镇痛作用。方法:通过冰醋酸所致小鼠扭体、二甲苯致小鼠耳壳肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、大鼠棉球肉芽肿等体外实验,及木瓜提取物调节脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌一氧化氮(NO)水平、一氧化氮合成酶(NOS)活性的体内实验,来研究木瓜提取物的抗炎镇痛作用。结果:木瓜提取物能明显减少小鼠的扭体次数、抑制二甲苯致耳壳炎症、降低小鼠腹腔毛细血管通透性及抑制大鼠肉芽肿;并有效降低LPS诱导RAW264.7细胞内NO水平、NOS酶活性。结论:木瓜提取物在动物体内及体外均有抗炎镇痛作用。
【关键词】木瓜;抗炎;镇痛
木瓜为蔷薇科(Rosaceae)木瓜属(Chaenomeles)落叶灌木植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa (sweet) Nakai的干燥成熟果实[1]。木瓜属的毛叶木瓜、西藏木瓜、光皮木瓜、日本木瓜等亦被入药[2]。木瓜植物目前在全世界约为5种,我国均产之,主要产于安徽、山东、湖北、贵州、西藏等地。木瓜性温、味酸、入肝、脾经。其始载于《名医别录》,为一种常用中药。其具有舒肝和胃、祛风顺气、�湿止痛的功效,用于胸闷不适、风湿筋骨疼痛、止吐、止泻等。目前对木瓜化学成份的研究表明,木瓜含有苹果酸、酒石酸、枸椽酸、齐墩果酸、维生素C及多种有机酸、�苷、黄酮类等化学成分[3]。其含有的齐墩果酸是一种不溶于水的三萜类化合物,据实验研究发现其具有抗炎、抗损伤和促进免疫的作用[4]。汪氏等[5]首次从宣木瓜中提取到木瓜总苷,并通过实验证明,木瓜总苷镇痛作用机制可能与其抑制外周炎症介质有关。本实验所用的木瓜提取物是从木瓜果实中分离提纯得到的,其主要成分是木瓜总苷。本实验通过小鼠扭体、二甲苯致耳壳肿胀、腹腔毛细血管通透性实验及大鼠棉球肉芽肿等体内实验及LPS诱导RAW264.7细胞的NO分泌水平及NOS酶活性的体外实验,探讨木瓜提取物的抗炎镇痛作用。为临床进一步开发和应用木瓜提取物提供理论依据。
1材料与方法
1.1动物昆明种小鼠,清洁级,体重 (20±2)g,雌雄各半,合格证号:2006A042;SD大鼠,清洁级,体重(160±20)g,雌雄各半,合格证号:2006B023。小鼠、大鼠均由南方医科大学实验动物中心提供。
1.2细胞RAW264.7细胞(小鼠单核/巨噬细胞系),购于南方医科大学病理生理学系。
1.3仪器设备和药品电子分析天平(Denver Instrument Company AA-160);离心机(上海安亭科学仪器厂,型号:TGL-16G-A);722型光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂)。
阿司匹林:SIGMA公司,批号:88H4012;冰醋酸:汕头市光华化学厂,批号:20060525;二甲苯:广东光华化学厂有限公司,批号:20060908;水合氯醛:中国医药集团上海化学试剂公司。批号:20030227;伊文思蓝:上海新中化学厂制造,批号:1-64-10-16;木瓜提取物:第二军医大学长征医院药剂科提供,批号:20060912;新生牛血清、DMEM培养基均为GIBCO公司产品。脂多糖(LPS):SIGMA公司分装产品。
一氧化氮测试盒(硝酸还原酶法):购于南京建成生物工程研究所,批号:20080818;一氧化氮合酶试剂盒:购于南京建成生物工程研究所,批号:20081211。
1.4实验方法
1.4.1木瓜提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响[6]昆明种小鼠50只,清洁级,体重 (20±2)g,随机分为五组(雌雄各半),每组均10只:模型组、阳性组(阿司匹林180mg/kg)、木瓜提取物低剂量组(100mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)、高剂量组(400mg/kg)。连续灌胃给药5d,每天一次,各给药组给予相应药物0.1ml/10g,模型组给予等剂量的生理盐水。d5给药后30min,每组均腹腔注射0.6%冰醋酸0.1ml/10g,并观察注射冰醋酸后15 min内各组小鼠的扭体次数并计算各药物组的扭体抑制率。
1.4.2木瓜提取物对二甲苯致小鼠耳壳炎症的影响[7]昆明种小鼠50只,清洁级,体重 (20±2)g,随机分为五组(雌雄各半),每组均10只:模型组、阳性组(阿司匹林180mg/kg)、木瓜提取物低剂量组(100mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)、高剂量组(400mg/kg)。连续灌胃给药5d,每天一次,各给药组给予相应药物0.1ml/10g,模型组给予等剂量的生理盐水。各组于未次给药30min后将0.05ml二甲苯涂于小鼠右侧耳壳,左侧不涂作为对照。至炎30min后处死小鼠,沿耳廓基线剪下双耳,用直径6mm的打孔器打下左右耳同一部位的圆片,在分析天平上称重,计算耳廓肿胀率,比较药物的抗炎作用。
1.4.3木瓜提取物对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响[8]昆明种小鼠50只,清洁级,体重 (20±2)g,随机分为五组(雌雄各半),每组均10只:模型组、阳性组(阿司匹林180mg/kg)、木瓜提取物低剂量组(100mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)、高剂量组(400mg/kg)。连续灌胃给药7d,每天一次,各给药组给予相应药物0.1ml/10g,模型组给予等剂量的生理盐水。各组未次给药1h后于小鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g,20min后脱颈椎处死,腹腔注入5ml生理盐水,轻揉腹部1min后剪开腹部吸出洗涤液6ml,1500r/min离心10min,取上清液用722型光栅分光光度计在590nm处比色测定吸光收度值(OD),计算各药物组的炎症抑制率。
抑制率(%)=(给药组OD值-模型组OD值)/模型组OD值×100%
1.4.4木瓜提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响[6]SD大鼠,清洁级,体重(160±20)g,随机分为五组(雌雄各半),每组均10只:模型组、阳性组(阿司匹林90mg/kg)、木瓜提取物低剂量组(50mg/kg)、中剂量组(100mg/kg)、高剂量组(200mg/kg)。各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹部剪毛并用碘酒消毒,再用75%酒精脱碘。沿腹中线切开皮肤约1cm长,止血钳扩充皮下组织至双侧腹股沟皮下并植入灭菌棉球(每个棉球10mg,高压灭菌),随即缝合皮肤,疮口处洒上磺胺粉。从手术当天开始各组灌胃给予相应药物1ml/100g,模型组给予等剂量的生理盐水,连续给药7d,每天一次。d 8处死大鼠,将棉球连同结缔组织一起取出,剔除脂肪组织,称湿重,置60℃烘干12h,称干重。按mg/100g体重表示,计算抑制率(%),进行组间比较。
肉芽肿净湿重=(棉球肉芽肿总湿重-原棉球净重)/大鼠体重×100
肉芽肿净干重=(棉球肉芽肿总干重-原棉球净重)/大鼠体重×100
湿重抑制率(%)=(给药组肉芽肿净湿重-模型组肉芽肿净湿重)/模型组肉芽肿净湿重×100%
干重抑制率(%)=(给药组肉芽肿净干重-模型组肉芽肿净干重)/模型组肉芽肿净干重×100%
1.4.5细胞培养RAW264.7细胞(小鼠单核/巨噬细胞系),在37℃、体积分数为5% CO2条件下,用含体积分数为10%新生牛血清、青霉素(100u/ml)、链霉素(100u/ml)的DMEM培养液传代培养。
1.4.6一氧化氮(NO)测定将对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔培养板中,约3×105/孔,设正常组、脂多糖(LPS) 5ug/ml(模型组)、0.2ug/ml、2 ug/ml、5 ug/ml木瓜提取物低、中、高剂量组。细胞培养贴壁后,各组加入相应药物,药物加入30min后各组再加入终浓度为5ug/ml的LPS,继续培养12h;收集培养液,按NO测试盒要求测定各组NO的吸光度值(OD),并算出NO含量。
1.4.7一氧化氮合成酶(NOS)测定将对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔培养板中,约1×105/孔,设正常组、脂多糖(LPS) 5ug/ml(模型组)、0.2ug/ml、2 ug/ml、5 ug/ml木瓜提取物低、中、高剂量组。细胞培养贴壁后,各组加入相应药物,药物加入30min后再加入终浓度为5ug/ml的LPS,继续培养12h;收集培养液,按一氧化氮合成酶(NOS)测试盒要求测各组NO吸光度值(OD),并算出NOS酶活力。
1.5统计学处理实验数据采用SPSS13.0进行统计分析,组间多项数据比较采用单因素方差分析,数据以(x±s)表示,P
