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[摘要] 目的 探讨不同浓度BMP-7与IL-6作用于体外培养的人髓核细胞对Ⅱ型胶原与TIMP-1基因表达的影响。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测不同浓度BMP-7与IL-6作用下体外培养的人髓核细胞中TIMP-1和Ⅱ型胶原基因的表达量。结果 IL-6可以下调Ⅱ型胶原基因和 TIMP-1基因表达;低浓度的BMP-7可以抵消相同浓度IL-6对髓核细胞的保护作用,高浓度的BMP-7可以促进Ⅱ型胶原基因和TIMP-1基因表达。结论 BMP-7可以对抗IL-6作用和正向调节椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因及TIMP-1基因表达,提示 BMP-7在临床治疗中可能具有逆转早期椎间盘退变的作用。
[关键词] IL-6;BMP-7;TIMP-1;Ⅱ型胶原;髓核细胞
[中图分类号] R681.5+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)04-24-03
Interaction of Bone Morphogenetic Protein-7 and Interleukin-6 on Gene Expression of TypeII-collagen and TIMP-1 in Human Nucleus Pulposus Cells in Vitro Cultured
FENG JunxiMA Xun*ZHANG LiWU XiaofeiHE Liming
Department of Orthopaedics,the Second Affiliated Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] Objective To discuss the interaction of different concentrations of bone morphogenetic protein-7(BMP-7) and interleukin-6(IL-6) on gene expression of typeⅡ-collagen and TIMP-1 in the in vitro cultured human nucleus pulposus cells. Methods We used the RT-PCR semi-quantitative detection of the gene expression levels of typeⅡ-collagen and TIMP-1 in the in vitro cultured human nucleus pulposus cells under the action of different concentrations of BMP-7 and IL-6. Results IL-6 reduced the gene expression levels of type II collagen and TIMP-1,and low concentration of BMP-7 could counteract the effects of the same concentration of IL-6 to protect the nucleus pulposus cells. High concentration of BMP-7 could promote the gene expression of typeⅡ-collagen and TIMP-1. Conclusion BMP-7 can antagonize the effects of IL-6 and regulate positively the gene expression of type II collagen an d TIMP-1 in the nucleus pulposus cells,suggesting BMP-7 could reverse the degeneration of intervertebral discs in the early stage of clinical treatment.
[Key words] Interleukin-6;Bone morphogenetic protein-7;Tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1;Type II-collagen;Nucleus pulposus cells
椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)的病因十分复杂,其中细胞外基质成分的合成减少和降解增加是造成椎间盘退变的重要因素之一。随着对椎间盘退变基础研究的逐步深入,细胞外基质在椎间盘退变病理机制中的作用日益受到重视。关于TIMP-1及Ⅱ型胶原相关实验证实,退变髓核细胞中TIMP-1和Ⅱ型胶原基因表达明显减少。椎间盘退变过程中有多种因子共同参与,IL-6是一种重要的炎性因子,能抑制成纤维细胞合成胶原,通过影响椎间盘髓核组织中的基质降解酶的抑制酶而产生效应的[1];而骨形态发生蛋白(BMP-7)具有促进椎间盘细胞增殖及促进细胞外基质合成的能力[2]。本实验主要观察椎间盘退变过程中的重要参与者IL-6与BMP-7对TIMP-1与Ⅱ型胶原基因表达的影响,进一步探讨IL-6 和BMP-7因子在椎间盘退变过程中的相互作用,为将来临床有效的治疗椎间盘退变提供理论和实验依据。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1组织来源人髓核组织取自3 例因脊柱侧凸行前路矫形手术患者,年龄13～15 岁,术前MRI检查证实实验用椎间盘信号与正常椎间盘信号一致。根据椎间盘退变评分系统,可作为正常的髓核组织。取材时严格无菌操作,均在取材后2h 内进行分离培养。
1.1.2试剂DMEM/F12 1:1培养液(Hyclone),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(Solarbio公司),IL-6(Miltenyi Biotec公司),引物合成(北京奥科生物技术有限责任公司),Trizol试剂(TaKaRa公司,大连宝生),随机引物(Promega公司,USA),逆转录酶M-MLV、Rnase抑制剂、DEPC水(TaKaRa公司,大连宝生),Taq DNA 聚合酶(Fermentas公司,USA)
1.1.3仪器CO2培养箱(Heraeus)、倒置显微镜(日本奥林巴斯公司Olympus,Japan)、紫外分光光度计(Gene Company Limited公司,USA)、PCR仪(PE公司9700型,USA)、UVP凝胶成像仪(UVP公司,USA)、稳压稳流电泳仪(Savant PS250,USA)。
1.2实验步骤
1.2.1椎间盘细胞的分离和培养在严格无菌操作下,术中取出椎间盘2h内作为实验材料。将取下的椎间盘用D-Hanks 液洗净,将髓核与纤维环及纤维环交界区用眼科剪分离,并将髓核剪碎至组织块小于1mm3,用0.25%的胰蛋白酶溶液于37℃水浴消化15min,随后用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4h,200目滤网过滤去除组织残留碎块。用DMEM/F12培养基加10%胎牛血清完全培养液终止消化,冲洗3次,加入培养液吹打均匀,计数后,将细胞分别接种于底面积为25cm2的培养瓶中,在37℃,体积分数5%的CO2培养箱(SANYO)中开始原代培养,隔2～3d换液。原代培养细胞达到90%融合时,加入0.25%胰酶,镜下见胞质回缩,细胞间隙增大时,吸去消化液,加入少许培养液,用吸管吹打瓶壁细胞,使之脱落形成细胞悬液。计数后将悬液按1:2 分装入培养瓶中继续培养。
1.2.2实验分组及处理细胞传至第三代且培养细胞达到90%融合时,计数后将其转至六孔培养板,每孔内约有2.5×105个细胞,并换用含12%胎牛血清的DMEM培养液,加入浓度分别为 ①0ng/mL (对照组);②IL-6组100ng/mL;③IL-6加BMP-7组 加入IL-6 100ng/mL同时加入BMP-7 100ng/mL;④IL-6加BMP -7组加入IL-6 100ng/mL同时加入BMP-7 1000ng/mL;⑤BMP-7组加入BMP-7 1000ng/mL,每个浓度三复孔,逐日于倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,共同孵育72h,收集细胞。
1.2.3逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionnpolyme-rase chain reaction,RT-PCR)采用TaKaRa公司Trizol一步法说明提取各组收集细胞的总RNA,每份样品取1μL稀释至500μL,紫外分光光度仪测纯度与浓度。取1μg 总RNA 用逆转录酶M-MLV进行逆转录,将逆转录产物cDNA模板1μL分别加入到总体积为25μL的反应体系中,混匀,离心,置于PCR仪内扩增,同时取等量cDNA扩增β-actin作为内参(各基因的引物序列及扩增片段见表1)。PCR反应条件:95℃ 2min预变性;然后95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 45s,共30个循环数;最后总延伸72℃ 10min。PCR产物加样于2% 琼脂糖凝胶进行电泳,紫外光凝胶成像系统扫描PCR 产物条带灰度,以目的基因与β-actin的灰度比值进行半定量统计分析,比值表示目的基因的相对表达水平,比值越大,其表达程度越高。
1.3统计学分析
采用SPSS13.0统计软件处理数据,计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用t检验,P0.05,说明BMP-7可以对抗IL-6引起的椎间盘退变作用;4组与5组相比差异不大,P>0.05,说明低浓度的IL-6对高浓度TIMP-1影响不显著,见表2。BMP-7可以对抗IL-6引起的椎间盘退变作用,并可以逆转早期椎间盘退变。
3讨论
椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是一种发病率很高的疾病。目前认为椎间盘退变起源于髓核,髓核软骨细胞对胞外基质的合成、分泌和转归起主导作用。多数研究认为髓核退变主要起因于髓核细胞和细胞外基质的改变,进而造成椎间盘生物力学异常,产生颈肩痛、腰腿痛等临床表现。椎间盘内许多因子参与了IDD的形成,主要包括促进椎间盘退变的因子如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子及基质金属蛋白酶(matrix metallop roteinases,MMPs)等;抑制椎间盘退变因子,如胰岛素样生长因子、转化生长因子β及骨形态发生蛋白家族(bone morphogen etic protein,BMPs)等[4]。随着生活、工作习惯及年龄的改变使椎间盘内各种成分的表达水平发生了明显的改变:促进椎间盘退变的因子合成增加,抑制椎间盘退变合成量减少,从而导致蛋白多糖和胶原合成减少、分解增加,最终出现IDD[5]。
近年来有研究表明IL-6是一种负性调节因子,可以引起软骨基质的降解,促进软骨的破坏。Kang等[6]研究发现,在突出椎间盘和正常椎间盘中IL-6均可表达,但突出椎间盘中分泌量较高。王民等[7]对体外培养正常及突出椎间盘组织观察发现突出腰椎间盘细胞中IL-6 含量高于正常椎间盘细胞,提示IL-6可能参与了腰椎间盘的退变过程。本实验结果显示单独加入IL-6作用后的人髓核细胞TIMP-1与Ⅱ型胶原基因的含量明显比对照组少,说明IL-6可以通过影响椎间盘髓核组织中的基质降解酶的抑制酶而产生效应,进一步影响细胞的生长和分化,降低II型胶原的含量,这与Kamemoto[1]等的研究结果一致。
骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein-7, BMP-7)是转化生长因子β(transformation growth factors-β,TGF-β)超家族成员一组分泌蛋白,又名成骨蛋白1(OP-1)。以往的研究表明BMP-7可以有效促进椎间盘组织合成细胞外基质,从而能够修复退变的椎间盘。Imai等[8]实验研究证实BMP-7基因同样具有促进细胞外基质合成、修复退变椎间盘的能力。我们的研究结果显示,在培养的有致炎因子IL-6的人髓核细胞中同时加入相同浓度BMP-7时,TIMP-1与Ⅱ型胶原基因表达增加,与只加入IL-6组有明显差异,但与对照组相比差异不明显,这说明BMP-7可以拮抗IL-6的作用,对细胞起到了一定的抑制退变作用;随着BMP-7剂量的增加,第四组与第三组相比,TIMP-1与Ⅱ型胶原基因表达有显著差异,第五组与第四组相比差异性并不明显,这说明随着BMP-7浓度增高可以明显促进人髓核细胞中TIMP-1与Ⅱ型胶原基因表达,但低浓度IL-6对高浓度BMP-7影响并不显著;在生理条件下高浓度BMP-7可以完全对抗椎间盘退变,促进Ⅱ型胶原表达,从而为髓核细胞生长分化提供适合的生理环境,阻止退变进一步发展。
IDD是一个慢性发展、长期存在的病理改变。本实验从IL-6与BMP-7共同作用于体外培养的髓核细胞方面进行了研究,证实了BMP-7在一定程度上可以抑制椎间盘退变,提示其在临床治疗中逆转早期椎间盘退变的作用,为后续研究和临床应用提供了一定依据;但BMP-7具有诱导成骨作用,大剂量、多次使用容易造成椎间盘骨化,怎样避免这种情况发生还有待进一步研究;同时椎间盘退变是多因素共同参与的结果,IL-6、BMP-7与其他因子之间的关系还不是很清楚,需要更深入的探讨研究。
[参考文献]
[1] Kamemoto M. Immunocytochemical study of matrix metalloproteinase-3 and inhibitor of metalloproteinase-1 in human intervertebral disc[J]. Spine,1996,21(1):1-8.
[2] Masuda K,Imai Y,Okuma M,et al. Biology of intervertebral matrix metalloproteinase-3[J]. Spine,2006,31(7):42-54.
[3] 赵勇,王宸. 白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)与椎间盘基质代谢[J]. 中国矫形外科杂志,2005,13(21):1668-1670.
[4] Roughley PJ. Biology of intervertebral disc aging and degeneration:involvement of the extracellular matrix[J]. Spine,2004,29(23):2691- 2699.
[5] 叶伟,马若凡. IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响[J]. 南方医科大学学报,2007,27(8):1187-1189.
[6] Kang JD,Georgescu HI,Mclntyre Larkin L,et al. Herniated lumbar intervertebral discs spontaneously produce matrix metalloproteinases,nitric oxide,interleukin26,and prostaglandin E2[J]. Spine,1996,21(3):271-277.
[7] 王民,李新友,刘淼,等. 白细胞介素-6在突出的腰椎间盘中的表达及其意义[J]. 中国脊柱脊髓杂志,2001,8(6):581-582.
[8] Imai Y,Miyamoto K,An HS,et al. The position of the aorta relative to the spine in patients with left thoracic scoliosis: a comparison with normal patients[J]. Spine,2007,32(12):1303-1309.
(收稿日期:2009-11-12)
