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郑声琴 何 杰 王建华 黄培林 高峰 [摘要]目的观察RegⅣ基因在大肠癌细胞系中的表达情况及其体外抗凋亡作用。方法采用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测4种大肠癌细胞系中RegⅣ基因的表达，通过MTr法分析不同浓度的姜黄素对4种大肠癌细胞系(HT-29、Caco2、Sw480和Lovo)的生长抑制作用，应用流式细胞仪评价RegⅣ基因的抗凋亡作用。结果RegⅣmRNA在HT-29细胞系高表达，Cac02细胞系较高表达，Sw480细胞系较低表达，Lovo细胞系不表达；RegⅣ蛋白在HT-29细胞胞核和胞质内表达阳性，Lovo细胞胞核和胞质表达阴性，Sw480细胞胞质内表达阳性，Caco2细胞胞质内表达弱阳性。不同浓度的姜黄素对4种细胞系的生长抑制作用强弱依次为Lovo>Sw480>Caco2>HT-29；用20μmol・L。的姜黄素处理24h后，4种细胞系的凋亡率大小依次为Lovo>Sw480>Cac02>HT-29。结论RegⅣ基因高表达与大肠癌发生可能有关；RegⅣ基因在大肠癌中可能具有抗凋亡作用。
[关键词]大肠癌；RegⅣ基因；细胞培养；免疫组织化学；抗凋亡
大肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，绝大多数大肠癌是由结直肠腺瘤恶变而来，即所谓的腺瘤一腺癌进程(adenoma-adenocarcinoma sequence)。腺瘤一腺癌进程发展使获得腺瘤差异表达基因在研究癌早期发生机制及相应的诊治中尤为重要。
RegⅣ(regenerating geneⅣ，RegⅣ)是近年发现的再生基因家族的一个新成员，是Reg家族在大肠腺瘤中高表达的差异表达基因。该基因在正常胃肠道及胰腺表达水平非常低，在炎症或肿瘤时可见原位或异位高表达，因此认为，它的高表达与腺瘤的形成、腺癌的发生有关。关于RegⅣ蛋白的生物学功能目前所知较少，国内外的文献仅限于对RegⅣ在大肠癌及癌前病变中的上调这一现象的描述，其作用机制目前并不清楚。RegⅣ在癌中的上调是癌发生的伴随现象，还是肿瘤特异性的基因变异?或者只是组织损伤的敏感的反应物?本实验旨在研究RegⅣ的差异表达对大肠癌细胞系凋亡的影响，并初步探讨RegⅣ基因的在大肠癌发生发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
HT-29、Cac02、Sw480和Lovo细胞系(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)，RPMll640(Gib．co公司)，Trizol(Invitrogen公司产品)，RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)，噻唑蓝(MTF，Sigma公司)，羊抗人RegⅣ多克隆抗体(R&D systerms)，HRP标记兔抗羊IgG抗体(DAKO)，sP系列工作液试剂盒SP9003(北京中杉金桥生物技术有限公司)，流式细胞仪(美国Becton公司)，姜黄素(国药试剂有限公司)临用时以二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解加培养液稀释至所需浓度，使DMSO终浓度为1％。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养kv0细胞置于含10％小牛血清，青、链霉素各10万u・L-1的RPMll640培养液中；HT-29、Caco2、Sw480细胞置于含20％小牛血清，青、链霉素各lO万U・L-1的1640培养液中。均于37度、饱和湿度、5％Co2培养箱中培养，12-24h换液1次。Lovo细胞用0.25％的胰酶消化，HT-29、Caco2、Sw480细胞用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，均以1：2或1：4传代培养。
1.2.2 RT-PCR扩增RegⅣ基因mRNA根据GenBank RegⅣ基因的cds序列(全长477bp)设计引物。上下游引物序列分别为5’-CATGGAATI"CATGGCTFCCAGAAGGATGCGG-3’和5’-CGCGGATCCCTATGGTCGGTACTrGCACAG-3’，β-action(270bp)上下游引物序列分别为5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3’和5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’。
以Trizol提取4种大肠癌细胞系的总RNA，然后进行逆转录合成cDNA，接着再按如下条件进行PCR扩增：94度2min预变性，94度30s变性、60度30s退火、72度延伸1min，30个循环后72度终末延伸7rain。1％琼脂糖电泳、拍照。
1.2.3 免疫组织化学染色检测癌细胞RegⅣ蛋白表达
4种细胞接种于培养皿中，内置盖玻片，观察细胞爬片2d，以40g・L-1多聚甲醛固定。免疫组织化学染色采用sP法，操作程序按照SP系列工作液试剂盒SP9003说明书进行，分别设阴性、阳性和空白对照。结果判定：阳性细胞为胞质和胞核显棕黄色颗粒。
1.2.4 MTI"比色法检测癌细胞抑制率取对数生长期的HT-29、Cac02、Sw480、Lovo细胞，调节细胞数为1×105ml-1，分别接种于96孔塑料培养板中，培养24h后更换培养液，使姜黄素的终浓度分别为1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100μmol・L-1。在37度、5％CO2培养箱中继续培养24h后，每孔加入MTr20μl，继续培养4h后去上清液，每孔加入DMSO 150μl，轻轻震荡，使各孔沉淀充分溶解，15min后用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算肿瘤细胞抑制率。肿瘤细胞抑制率=1-加药孔细胞A值／对照孔细胞A值。最后以抑制率为纵坐标，以浓度梯度为横坐标绘制曲线，求出IC50值。
1.2.5 流式细胞仪检测癌细胞凋亡 用浓度为20μmol・L-1的姜黄素干预4种细胞，共培养24h。姜黄素干预后的细胞用冷磷酸缓冲液(PBS)洗涤后用1倍的缓冲液稀释细胞数至10×106ml-1，吸取100μl的细胞悬液至5ml试管中，加入5μlFITC标记的放线菌素(annexinV-FITC)及5μl碘化丙啶(PI)，轻柔的摇动细胞悬液后于室温下避光保存15min，每管加入400μl缓冲液混合后上流式细胞仪检测。
1.3 统计学处理
采用统计软件SAS8.2对细胞凋亡率进行单因素方差分析，P Lovo细胞系未见表达。免疫组织化学染色显示。HT-29 RegⅣ蛋白表达阳性，Sw480细胞表达较HT-29略弱，Caco2表达弱阳性，Lovo细胞表达阴性。
2.2 姜黄素对细胞生长的抑制作用
不同浓度的姜黄素对HT-29、Caco2、Sw480、Lovo细胞的IC卯分别为46.8,40.1、28.1和18.2μmol・L-1。不同浓度的姜黄素对Lovo细胞生长抑制最强，对HT-29细胞生长抑制最弱，Cac02和Sw480介于二者之间。
2.3 不同大肠癌细胞的凋亡率
用浓度为20μm0lL-1的姜黄素干预24h后HT-29、Caco2、Sw480和Lovo细胞的凋亡率。
3 讨论
RegⅣ为Reg家族最新成员，于2001年被发现。人的RegⅣ基因位于1号染色体，属于单拷贝基因，有5个内含子及6个外显子，编码158个氨基酸，包括22个氨基酸的信号肽及一个保守的钙依赖碳氢化合物识别域。Zhang等报道，RegⅣmRNA在结直肠腺瘤一癌进程中丰度最高，认为RegⅣ过度表达可能是结直肠癌发生的早期事件。
本实验用RT-PCR和免疫组织化学染色方法对4种大肠癌细胞系进行RegⅣ基因表达水平检测，结果显示：具有黏液分泌表型的腺癌细胞系HT-29细胞的胞质中高表达RegⅣmRNA及其蛋白，而类似于小肠上皮细胞无黏液分泌的Cac02细胞的RegⅣmRNA及其蛋白表达介于HT-29和Sw480细胞之间；Sw480低表达RegⅣmRNA及其蛋白，而高转移性的Lovo细胞系不表达RegⅣmRNA及其蛋白。本课题组高峰等基因转染结果和Violette等的研究均证实了HT-29细胞系RegⅣ基因高表达，Lovo细胞系不表达RegⅣ基因；在大肠上皮分化的黏液性肿瘤细胞(HT-29)中RegⅣ高表达；非黏液性肿瘤细胞(cac02和Sw480)或高转移性的(Lovo)癌细胞RegⅣ基因表达程度降低。这一特性可能与癌细胞分化程度有关。由于高分化的HT-29细胞与正常大肠上皮细胞相似，具有分泌黏液和糖蛋白的功能，而RegⅣ蛋白存在于分泌的黏液中，所以失去分泌黏液功能的细胞，同时也失去了RegⅣ蛋白表达，说明RegⅣmRNA和蛋白表达与大肠癌的分化程度有关，很可能在癌的启动阶段起作用。
细胞凋亡在肿瘤发生、发展过程中主要起负调控作用，可以阻遏肿瘤细胞迅速生长。据报道，RegⅣ与Reg I同属Reg家族，同源性较强，功能相近，同样都在结直肠癌中表达上调，组织发育异常时高表达。目前认为，RegⅣ基因引导一种生理过程，这种过程会关闭凋亡信号的开关。Reg蛋白是除了表皮生长因子，转化生长因子α、β和肝细胞生长因子之外的另一个对胃细胞再生起作用的基因蛋白。Ose等的研究进一步揭示了鼠RegⅣ的促进增殖和再生作用是小肠绒毛增殖和修复所必需的。Reg Iα基因的表达还提示胃黏膜的再生进程。故推测RegⅣ也具有促进增殖和再生作用，其机制可能是通过抗凋亡途径。姜黄素可以诱导细胞凋亡，20μmol・L-1姜黄素作用细胞24-36h后，DNA电泳可出现凋亡特异性的梯形条带，细胞的形态学也发生相应的改变，可以见到凋亡小体。本实验用同一浓度的促凋亡剂姜黄素作用于4种不同程度表达RegⅣ的癌细胞后，结果显示癌细胞的生长抑制率大小依次为LovoLovo>Sw480>Cac02>HT-29，而癌细胞的凋亡率大小依次为Lovo>Sw480>Cac02>HT-29：在癌细胞RegⅣmRNA和蛋白表达从高到低依次是HT-29>Cac02>Sw480>Lovo。高表达RegⅣ的癌细胞能明显抵抗促凋亡剂姜黄素的作用，而无RegⅣ表达的细胞在姜黄素应用后细胞凋亡明显增加。说明RegⅣ具有抗凋亡作用，因此，RegⅣ有可能也是一个抗凋亡因子，可能通过抑制凋亡促进肿瘤细胞的生长。
Violette等研究结肠癌耐药相关基因时发现，RegⅣmRNA过度表达可能与结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤的耐药有关，其作用机制有待于进一步研究。
