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角质层在表皮的最表层，由多层扁平的角质细胞组成。这些细胞是已经完全角化的细胞，核和细胞器都已消失。在HE染色切片上呈均质伊红色，细胞轮廓不清，最表面的细胞连接松散，趋向脱落，即称为鳞屑。角质层粘贴技术，是用涂有粘性材料的胶带、圆盘或者玻片粘贴皮肤，作用于表皮角质层的粘附力可使鳞屑脱落，从而观察角质层的生理和病理学变化，此技术被广泛用于药物、化妆品的动力学研究和观察活性物质的渗透深度[1]。本文对常用的几种角质层粘贴材料、粘贴技术、临床应用等作一综述。
1 角质层粘贴材料
1.1 D-SquameR粘贴盘：D-SquameR(Cuderm Corp, Dllas, TX, U.S.A.) 粘贴盘，由透明聚酯薄膜构成的小圆盘，上面覆盖压力敏感粘合剂。在一定压力（10～25kPa或100～250g/cm2）下将D-SquameR盘粘在皮肤测试部位并持续一定的时间（5、10、30s），移去D-SquameR盘，一些鳞屑粘附在上面。胶带粘取角质层数量的多少受多种因素的影响，例如胶带粘贴的方式、次数、粘贴施加的压力、时间、皮肤的含水量、皮肤角质层细胞之间的内聚力、不同的身体部位和个体差异[2-4]。
1.2 CorneofixR ：CorneofixR（Courage+Khazaka GmbH, Cologne, Germany）一种透明聚酯薄膜胶带，胶带的一侧有个延伸出来的手柄，方便操作者持捏，而不污染粘贴鳞屑的待测部位。胶带可以根据测试部位的面积剪取不同的大小，准备测试部位后把胶带的粘着面与皮肤接触，用手指轻轻滚动按压胶带，并停留5s、10s、30s，以均匀的速度撕去胶带，一些鳞屑粘附在上面。该方法容易受到外界物质，如头发、灰尘等影响，因此采集到的贴片应立即分析或者保存完整再分析。
1.3 其他：BlendermR(3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany)，是一种外科常用的透明胶带，透过胶带可观察伤口的变化，并且不受手指和手部的运动限制，它适用于持续很长一段时间。还有学者用TransporeR(3M, St. Paul, MN,USA,batch no.2002-12 AP)和MicroporeR(3M,St.Paul, MN,USA,batch no.2001-08 AN.)等胶带进行研究[2,5]。
2 胶带粘贴角质层分析技术
2.1 视觉评估：根据胶带粘附的鳞屑密度对照标准评估背景卡作视觉评估，此方法简单、快捷，但只适合通常的主观评分，不能用来测量实际的脱落量，也不能衡量粘附鳞屑的分布情况[6]。
2.2 定量分析法：根据胶带粘附的鳞屑计算其面积，也可以通过光反射来定量反映鳞屑的量。有研究者利用计算机分析D-SquameR粘贴盘所捕捉的鳞屑的图像视频，并用三个参数来描述，分别为SURFP（粘贴盘的黏附面积）、SMOD（平均光反射）、HI（异质性指数，即鳞屑平均密度）[7]。此种利用计算机分析D-SquameR粘贴盘上鳞屑参数的技术弥补了临床肉眼视觉评估的不足，并能够很敏感地反映皮肤鳞屑的变化及皮肤含水量的变化。CorneofixR胶带所粘取的鳞屑，利用VisioscanR（VC98,C-K electronics, Koln, Germany）采集、分析，并得出相关鳞屑参数，然后结合SELS（Courage+Khazaka GmbH, Cologne, Germany）系统自动化分析视频图像。CorneofixR参数包括：PA（完全覆盖于正常角质层细胞的面积百分比）、AI（每平方毫米所完全覆盖的正常角质层细胞）、DI（脱屑指数，根据不同角质形成细胞的分布来计算）[8]。
2.3 光学立体成像技术分析法：有学者研制出一种新型的成像装置（Corneosizer）无创观察、分析皮肤角质形成细胞的特征[9]。该装置利用落射荧光显微镜技术，原理是卤钨灯产生的光线在485nm过滤后通过分光镜聚焦在带有10倍物镜成像光纤束的近端，荧光再被同一成像光纤束收集后，通过上述分光镜再在503nm过滤。带有计算机支持的多组线性电荷耦合器件（charge coupled device, CCD）感应器的相机可在数秒内获取荧光图像。该技术安全、无创、使用简单，能在大多数皮肤表面应用，研究者能较容易操作软件并选择目的皮肤区域，能更加清楚观察不带毛发的皮肤区域的角质形成细胞（如唇红部位），并能快速成像测定角质形成细胞的大小。
2.4角质层细胞的分离与保存：将撕下的胶带用胶带切割机切割成1cm2的大小。1cm2的胶带放入1.5ml聚丙烯的管中，加入1.5ml的二甲苯溶液。10min后，用镊子把胶带从管中除去，在3000rpm的离心机中离心5min，弃掉上清。然后向管中加入100%的乙醇1.5ml。乙醇悬浊液里，角质细胞呈现为白色沉淀物。再一次离心3000rpm 5min，弃掉上清。为了让残留的乙醇蒸发掉，将沉淀物在减压下干燥，从而分离出角质细胞。此时，用显微镜观察角质细胞时，可用1%结晶紫与0.5%亮绿的混合液染色5min，用水洗净。分离出的角质细胞可以进一步分析其细胞结构和蛋白质。分离后如果暂时不使用，可以将样品保存在-20℃的环境下，待后期分析[10]。
2.5 多种生物标记物和细胞因子的定量分析：生物标记物主要有皮质醇、可溶性纤维连接蛋白、人血清白蛋白、内披蛋白、不可溶性的角蛋白6、1、10、11等。表皮蛋白质主要分为角蛋白和角蛋白中间丝相关蛋白。角蛋白是角质形成细胞的主要结构蛋白，呈纤维状，直径约为10mm，属于中间丝家族。根据角蛋白基因核酸序列的同源性将其分为两型，Ⅰ型分子量较小，呈酸性，Ⅱ型分子量较大，呈碱性。成熟的角蛋白纤维是由Ⅰ型和Ⅱ型以1:1比例聚合而成的异种二聚体，因此，在表皮中角蛋白是成对表达的。角蛋白对的表达，即分化特异性K1/K10。角蛋白基因的正确表达和角蛋白细胞骨架的完整构建是表皮物理屏障功能结果的基础。在表皮细胞向终末分化的过程中，还涉及一些重要的中间丝相关蛋白，如丝聚合蛋白，兜甲蛋白，内披蛋白，角质形成细胞转谷酰胺酶，小分子富含脯氨酸蛋白等。主要催化角质套膜蛋白的内披蛋白等，形成异常不溶性角质套膜，为表皮独特的角质层屏障结构。测定胶带所粘取的角质层蛋白，由胶带粘取后的鳞屑放入玻璃小瓶中，然后加入4ml甲醇，振荡1h，弃掉上清，把甲醇彻底蒸发，再加入4ml 1M的NaOH，振荡离心2h后在室温过夜。角质层总蛋白质或者可溶性蛋白质的含量测定用Bio-Rad公司的蛋白检测试剂盒(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)，使用牛血清白蛋白作为标准，空白的胶带作为对照。细胞因子的测定，先加入2ml磷酸盐缓冲液和0.005%Tween-20于每个玻璃硅烷样品瓶中，然后每个小瓶放在冰块冷却30min。使用带有探针的超声装置在冰水中提取15min。提取液离心1min和225ml的上清分装被重新冻结在-80℃，直到需要进一步的分析。提取物分析细胞因子（IL- 1α、TNF-α, IL8, IL1RA, and IL10）使用特定的酶联免疫吸附试验试剂盒[11]。
3 角质层粘贴技术在皮肤科的临床应用
角质质粘贴技术在皮肤科临床诊断、治疗标准及化妆品无创评价领域有广泛的应用，现在越来越受到皮肤科医生及化妆品研究人员的关注。
3.1 皮肤干燥类疾病：针对干燥性皮肤病的患者，医生可采用角质粘贴技术测量不同部位的鳞屑变化、角质层鳞屑参数的显著减小来反映药物或者保湿产品的疗效。比如银屑病的患者，现在有许多学者采用D-SquameR或者CorneofixR胶带粘取皮肤鳞屑标本，行苏木精-伊红染色后，在显微镜下计数角化不全细胞数[6]。根据客观测量角化不全细胞数目的多少评分，结合之前观察者主观评判银屑病皮损面积和严重程度指数，完善而又相对准确的判断银屑病严重程度及病情变化，指导临床合理用药。有研究者研究医护工作人员的手部和前臂皮肤的角质层细胞因子和结构蛋白的变化，医护人员的手部长时间重复性的暴露在医疗环境中及频繁清洁手部皮肤，得出其手部皮肤的角质层细胞因子和结构蛋白明显比前臂皮肤减少的结论[12]。
3.2 皮肤屏障缺陷类疾病：在面部皮炎（如玫瑰痤疮）的患者中，其皮肤屏障功能有较明显的缺陷，与正常皮肤相比，面部皮炎患者发生过敏或者刺激反应的概率很高。那么皮肤屏障受损后，使得角质层内的丝氨酸蛋白活性增强。那么，就有学者利用胶带粘贴技术对面部皮炎患者的病变部位进行粘脱，分析其角质层的丝氨酸蛋白活性和量化表皮抗菌肽cathelicidin的含量，从而研究氨甲环酸（丝氨酸蛋白抑制剂）的皮肤屏障修复功能。同时，角质粘贴技术可以用于破坏皮肤的屏障，利用胶带多次粘贴角质层后，造成皮肤屏障破坏，然后于不同次数粘贴后测定皮肤角质层的含水量、经皮失水（TEWL）、pH、皮肤颜色、油脂等参数，观察其与正常皮肤的变化[2,13]。
3.3 皮肤细菌、真菌类疾病：皮肤细菌、真菌感染患者就诊时，医生可采用胶带取皮肤鳞屑标本，用于细菌、真菌镜检、培养和分析，从而确定诊断及治疗方案。有学者用D-SquameR圆盘在六条健康犬的耳廓处粘取角质层，图像分析量化胶带所粘取的真菌数量[14]。在皮肤科临床诊断中，比如痤疮、酒渣鼻等患者，医生都会建议患者进行细菌或者毛囊虫的检查，即可用胶带法粘贴，然后镜下观察。
3.4 内分泌类疾病：有学者利用96例皮肤外观正常的糖尿病患者和83例非糖尿病患者作对照，比较皮肤的脱屑率[15]。利用D-SquameR圆盘粘取糖尿病患者的皮肤角质层，然后用照片分析技术定量评估胶带鳞屑值，鳞屑的光反射量代表了鳞屑的量，单一的反射代表鳞屑的大小和分布，从而观察糖尿病患者与非糖尿病患者的角质层脱落率的变化。
4 角质层粘贴技术在化妆品中的应用
4.1 保湿类化妆品的功效评价：皮肤鳞屑的产生是人体皮肤干燥的一个反映，通过利用角质粘贴胶带采取鳞屑样本来评价保湿产品的功效性已经被广泛应用[6,16]。所取的鳞屑样本在黑色的背景下观察白色的鳞屑，然后在两个对立相反的氙气灯源下观察，提供了一个更加均匀的光源环境，而且降低了多余的光源干扰。样本所反射的光在50倍的放大镜下捕获视频，然后连接到计算机系统，软件图像采集、存储、分析。最后通过计算机软件计算SURFP、SMOD、HI三个参数，从而比较使用保湿产品前后皮肤的鳞屑参数变化[7]。
4.2 抗皱类化妆品的渗透力度：皮肤的沟纹、皱纹是人体皮肤的典型结构，通过观察皮肤的沟纹、皱纹来评价外用化妆品或药物的渗透能力和生物利用度。使用透明胶带膜具有很高的灵活性，胶带激烈接触皮肤，并施加压力横向移动，是先决条件，以获得正确的数据。胶带的应用剥离角质层观察其剖面的结构和角质层上物质分布。实验结果表明，胶带剥离角质层过程是一个有价值的技术，定量反映抗皱类化妆品进入人体角质层剖面的渗透力度和生物利用度[17]。
4.3 去屑型洗发护发产品的功效评价：有学者用一个随机双盲临床试验对两个组30名诊断为中度至显著头屑的受试者进行观察，两组分别使用非焦油类洗发水（含水杨酸、硫磺、吡啶硫酮锌、酮康唑等物质）和0.5%焦油类洗发水。使用透明胶带膜粘贴头皮屑，比较两种洗发水的去屑效果及抗马拉色菌的效果。实验发现非焦油类洗发水和0.5%焦油类洗发水的去屑效果一致，但是前者的抗马拉色菌效果更强[18]。
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[收稿日期]2012-01-17 [修回日期]2012-03-13
编辑/李阳利
