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【摘要】 目的 探讨Syk基因在子宫内膜良、恶性组织中的表达及其启动子甲基化与子宫内膜癌发生、发展的关系。方法 采用RT�PCR方法检测52例子宫内膜癌及癌周组织、30例子宫内膜不典型增生、28例复杂型�生、30例单纯型增生和40例正常内膜组织中Syk mRNA 的表达情况，同时采用MSP方法检测其基因启动子甲基化情况。结果 在子宫内膜癌组、癌周组织、不典型增生组、复杂和单纯型增生及正常子宫内膜组中Syk基因表达依次增高，Syk基因甲基化程度依次降低，差异有统计学意义(P0.05)；子宫内膜癌中Syk基因的阳性表达及甲基化程度与癌症的临床分期(χ�2=4.65，P0.05;χ�2=0.94，P>0.05)。Syk基因启动子甲基化与Syk基因表达缺失明显相关(P0.05;χ�2=0.94，P>0.05). Promoter methylation of Syk gene was positively correlated loss expression of Sky gene.Conclusion Promoter methylation of Syk gene may be one reason for inactivation of it, which may cause the occurrence and development of endometrial cancer.�
【Key words】
Endometrial cancer; Syk gene; Promoter; Methylation
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作者单位：277100山东省枣庄市妇幼保健医院
子宫内膜癌是女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一，发病率呈明显增高和低龄化趋势1，2］，发病原因及机制尚未完全阐明。近年来，脾酪氨酸激酶基因(spleen tyrosine kinase, Syk)引起了国内外学者的重视，认为Syk 基因是一种新发现的候选抑癌基因，其失活可能与某些肿瘤的发生有关，其启动子甲基化可能是基因失表达的重要原因，但目前在子宫内膜癌中尚无相关研究。本实验拟通过RT�PCR和甲基化特异性PCR检测Syk基因在子宫内膜良、恶性组织中的表达情况及其甲基化状态，探讨Syk基因启动子甲基化在子宫内膜增生及其恶变过程中的作用和意义。�
1 资料与方法�
1.1 一般资料 选取我院2005年1月至2010年12月手术治疗的子宫内膜癌患者52例,年龄38～72岁，中位年龄52岁。按照FIGO (2000年)子宫内膜癌分期：Ⅰ期26例、Ⅱ期15例、Ⅲ期8例、Ⅳ期3例；组织学分级：G��1� 18例、G��2� 级 24例、G�3级10例。术后病理证实肌层浸润深度＞1/2者 29例、≤1/2者 23例；有淋巴结转移8 例，无淋巴结转移44例。同期收集距子宫内膜癌肿瘤边缘1 cm的癌周组织52例、子宫内膜单纯性增生过长30 例、子宫内膜复杂性增生过长28例、子宫内膜不典型增生30 例、因子宫脱垂或输卵管卵巢囊肿行子宫切除的正常子宫内膜40例作为对照组。取得标本迅速置液氮冷冻，�80 ℃冰箱保存备用。所有标本均经病理证实，临床资料完整，术前均未经放疗、化疗及激素治疗。�
1.2 主要试剂 RNA 抽提及RT�PCR试剂盒均购自大连宝生物公司、DNA提取试剂盒购自上海华舜试剂公司、甲基化修饰及纯化试剂盒为美国EPIGENTEK公司产品。�
1.3 RNA提取 取100 mg的标本应用RNA提取试剂盒,按说明书要求提取RNA后于紫外分光光度计测OD��260�/OD��280�定量并检测其纯度，�70℃冰箱保存待用。�
1.4 RT�PCR反应 取 1 μg总RNA逆转录为cDNA 后，取2.0 μl cDNA 为模板于20 μl体系进行PCR 扩增，引物由上海生物工程公司合成，Syk引物序列Primer1：5��TTCTCCAGCAAAAGCGATGTCT�3�， Primer2：5��TTTC CACATCGTATGTCCAGCA�3�，产物长度199bp,反应参数：94 ℃ 5 min,94 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s, 30 个循环, 72 ℃ 10 min。内参照GAPDH引物Primer1：5��TCATGGGTGTGAACCATGAGAA�3�， Primer2： 5��GGCAT GGACTGTG GTCATGAG�3�，扩增片断115bp，反应参数：95 ℃ 15 min,95 ℃ 1 min,62℃ 1 min,72 ℃ 1 min, 30 个循环, 72 ℃ 10 min。3 μl PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下经Biocaptmw软件分析进行半定量分析。�
1.5 DNA 的准备和MSP 取50～100 mg标本按照DNA提取试剂盒的说明书提取DNA，测定OD值确定其浓度和纯度。DNA甲基化修饰严格按照试剂盒上的说明。修饰的DNA 应用PCR 试剂盒进行巢式双重PCR,首轮PCR 的引物为:5��GATTAAGATATATTTTAGGGAATATG�3�(sense), 5��CACCTATATTTTATTCACATAATTTC�3�(antisense),扩增长度600 bp。PCR 反应条件: 94 ℃ 5 min,94 ℃30 s,57 ℃30 s,72℃30 s,35 个循环,72 ℃延伸10 min。取首轮PCR 产物1.0 μl 进行第2 轮双重PCR。甲基化特异性引物为:5��CGATTTCGCGGGTTTCGTTC�3�(sense),5��AAAACGA ACGCAACGC GAAAC�3�(antisense),扩增长度243 bp,包含9 个Cp G 岛。非甲基特异性引物为: 5��ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG�3�(sense), 5 ��ACTTCCT TAACACACCCAAAC�3�(antisense)， 扩增长度140 bp,包含8 个Cp G 岛。甲基化和非甲基化的引物置于同一个反应中进行扩增,反应条件除甲基化的退火温度为59 ℃30 s、非甲基化的退火温度为54 ℃30 s，25 个循环外,其他均与首轮PCR 条件相同。第2 轮PCR 产物2.0～5.0 μl 经过2 %琼脂糖电泳、溴化乙锭染色后,在凝胶成像系统下观察成像记录结果。双重PCR 产物中,出现243 bp 产物,则为Syk基因存在甲基化,出现140 bp 产物,认为基因存在非甲基化。�
1.6 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理,两组之间的比较采用t检验，率的比较采用χ�2检验，认为P0.05)，见表1。�
表1
SykmRNA基因在不同子宫内膜组织中的�表达水平(x±s)
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组别例数SykmRNA基因表达水平
子宫内膜癌520.54±0.33
癌周组织520.71±0.30
不典型增生300.92±0.42
复杂型�生过长281.18±0.38
单纯型增生过长301.28±0.48
正常子宫内膜401.31±0.86
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图1
SykmRNA电泳图�
N1:正常组织；N2：癌周组织；T：肿瘤组织；C: 对应内参GAPDH
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2.2 SykmRNA基因在不同子宫内膜组织中阳性表达率
SykmRNA基因在子宫内膜良、恶性增生及正常子宫内膜间的阳性表达率不同或不完全相同(χ�2=81.1,P0.05)及正常子宫内膜(χ�2=1.4,P>0.05)之间差异无统计学 意义, 见表2。�
表2
SykmRNA阳性表达率在各组子宫内膜组织中的情况(例，%)
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组别例数Syk基因表达Syk基因表达缺失阳性表达率(%)
子宫内膜癌52173532.7
癌周组织52292355.8
不典型增生3022873.3
复杂型�生过长2827196.4
单纯型增生过长30300100.0
正常子宫内膜40400100.0
2.3 SykmRNA阳性表达与子宫内膜癌各病理参数之间的关系
结果显示，子宫内膜癌组织中Syk的阳性表达与子宫内膜癌的临床分期(χ�2=4.65，P0.05),表3。�
表3
SykmRNA表达与子宫内膜癌各病理参数之间的关系
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临床病理指标例数(n)
SykmRNA
+�
阳性率(%)χ�2P值
组织学分级
G��1�+ G��2�42182442.90.03>0.05
G��3�104640.0
临床分期
Ⅰ+Ⅱ期41261563.44.650.05)，见表5。�
表5
Syk基因启动子甲基化与子宫内膜癌病理参数之间的关系(例，%)
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临床病理指标例数
Syk甲基化
+�
阳性率χ�2P值
组织学分级
G��1�+ G��2�42142833.30.94>0.05
G��3�105550.0
临床分期
Ⅰ+Ⅱ期41122929.34.333］， Syk的表达与多种细胞功能及恶性肿瘤播散、发病机制有关，是控制细胞生理功能的关键分子4］。�
本研究发现，Syk mRNA的表达水平从正常组织到子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌周组织及子宫内膜癌组织中的表达呈进行性下降，这与Sada K等5］研究结果相符，后者认为Syk 的缺失会导致免疫细胞发育、成熟障碍,由于机体免疫细胞的成熟障碍,机体的免疫监测会下降,从而对突变、异常增生的细胞失去免疫力,导致肿瘤的宜发。本研究还发现，Syk mRNA在正常子宫内膜组织和子宫内膜单纯性增生过长、子宫内膜复杂型增生过长中的表达无显著性，这与子宫内膜单纯型增生及复杂型增生恶变率低仅1%和3%，具有逆转现象相符。提示Syk mRNA 的表达缺失可能与子宫内膜癌的发生有关，Syk表达缺失，使机体失去了对变异细胞的监测和杀灭作用,从而导致肿瘤的发生。正常子宫内膜组织中的高表达的Syk能够抑制子宫内膜过度增殖和恶性转化,从而维持其良性组织的特性。�
本研究发现，子宫内膜癌组织的临床分期越晚、肌层浸润越深Syk表达越低，有淋巴结转移者中Syk的表达低于无淋巴结表达的内膜癌，提示Syk基因可能与子宫内膜癌的浸润、转移有关，Syk基因的表达缺失可能与子宫内膜组织向恶性型发展、发生局部浸润和远处转移以及预后不良存在密切的关系。目前，国内外尚无此类研究。但该结果与目前理论相辅6］，Carter等7］认为，Syk与HER2/neu是一对功能相反的抑癌/癌基因，HER2/neu的过度表达可诱导血管内皮细胞的收缩，从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障，易于发生转移，而Syk可抑制HER2/neu的收缩血管内皮细胞作用，从而抑制肿瘤的转移8］。Wang S等9］在胃癌中也得出类似的结论。但是本实验发现Syk基因在子宫内膜癌中的表达与肿瘤的组织学分化程度无关，这与临床上未分化或低分化癌转移能力较高、预后较差不符，可能系由于病例数太少, 有待于扩大病例进行深入研究，提示Syk可能不是影响子宫内膜癌预后的惟一因素。�
越来越多的研究表明,甲基化可能是肿瘤抑制基因失活的主要原因。据估计,大约50%的人类基因5�端启动子调节序列有CpG核酸(CpG岛)。绝大多数基因CpG岛没有甲基化,在肿瘤发生、发展过程中,常观察到某些基因的CpG岛甲基化。异常甲基化可导致基因表达的异常调节。本研究通过Syk基因启动子甲基化的检测，发现Syk基因启动子甲基化与Syk基因的表达水平变化趋势成反相相关，发生甲基化的组织中Syk mRNA 的表达缺失，而未发生甲基化的组织中Syk mRNA 均有表达，提示Syk基因的缺失而丧失对正常子宫内膜的维持作用可能是通过Syk启动子甲基化而实现的，甲基化可能是子宫内膜癌发生、发展过程中的重要机制之一。在乳腺癌、肝癌、结直肠癌中也已得出类似的结论10,11］。本实验还发现子宫内膜癌中Syk基因启动子甲基化与子宫内膜癌的临床分期、淋巴结转移、肌层浸润深度密切相关，提示Syk基因启动子甲基化可能是内膜癌发生侵袭转移的一种机制。Syk基因启动子甲基化可能是Syk基因失活的重要机制，可能与肿瘤的复发转移相关，这为子宫内膜癌发展转移及预后提供了一个可能的新的分子标志物。�
总之，Syk基因的缺失或低表达可能与子宫内膜的恶变及浸润转移密切相关，Syk基因启动子甲基化可能是该基因表达缺失的重要原因，Syk 基因启动子甲基化有可能成为子宫内膜癌的肿瘤标记,从而为评估肿瘤风险、制定预防策略、获得早期诊断和跟踪肿瘤预后提供指导，对子宫内膜癌的靶向基因治疗提供新的生物治疗靶点。�
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