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[摘要] 目的:探讨急性早幼粒细胞白血病(APL)患者早期死亡的临床特点。方法：分析早期死亡APL患者形态学、免疫分型、染色体核型和PML/RARα融合基因特点,并详细记录年龄、性别、起病时白细胞(WBC)计数、血小板(BPC)计数、血红蛋白(Hb)含量、骨髓中早幼粒白血病细胞占单个核细胞百分比(BMLP%)、纤维蛋白原浓度(Fib)等。结果：63例APL患者中13例早期死亡,早期死亡率20.63%。13例早期死亡APL中,7例起病时外周血白细胞大于10×109 L-1,9例形态学上表现为M3v,8例为CD34+,8例为CD2+,9例PML/RARα融合基因BCR3亚型,与非早期死亡组相比形态学、免疫分型、染色体核型和PML/RARα融合基因特点等存在统计学差异。除1例死于维甲酸综合征外,其余12例均死于脑出血。结论：外周血高白细胞,形态学表现为M3v、CD34+、CD2+和PML/RARα融合基因BCR3亚型APL早期死亡率极高,临床预后差。
［关键词］ 白血病,早幼粒细胞,急性； 免疫表型； 早期死亡
［中图分类号］ R733.71 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1671-7256(2011)02-0169-04
doi：10.3969/j.issn.1671-7256.2011．02.014
Clinical features of acute promyelocytic leukemias developing early death
HE Bai, GU Wei-ying, CAO Xiang-shan, WU Hao-qing, QIU Guo-qiang, WANG Zhi-lin, XIE Xiao-bao, HUA Xiao-ying, DONG Wei-min
(Department of Hematology, the Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou 213003, China)
［Abstract］ Objective: To investigate the clinical features of acute promyelocytic leukemias developing early death. Methods: 13 de novo acute promyelocytic leukemias developing early death hospitalized from May 2001 to Aug 2010 were enrolled in this study. All cases had outcomes available for complete blood counts, peripheral and bone marrow blast count, immunological markers, PML/RARA fusion gene type, coagulation laboratory parameters. Results: Among the 63 patients, 13 cases developed early death with a early death rate of 20.63%. Out of the 13 early death patients, 7 were leukocytosis with peripheral white blood cell counts of more than 10×109 L-1 at initial diagnosis, 9 were morphologically diagnosed as M3v, 8 were CD34+, 8 were CD2+and 9 were BCR3 type of PML/RARA fusion. Except 1 case died of severe retinoic acid syndrome, the rest 12 patients were all died of intracerebral bleeding. Conclusions: CD34 expression in APL is an unique clinical feature associated with leukocytosis, atypical morphology of M3v, high expression of CD34 and CD2, and the S-form(BCR3) of the PML/RARα fusion genes are associated with early death in acute promylocytic leukemias.
［Key words］ acute promyelocytic leukemia; immunophenotype; early death
急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种特殊类型急性髓细胞白血病(AML),主要特点为大量的白血病细胞阻滞在早幼粒细胞分化阶段,形态学上骨髓中以颗粒增多的异常早幼粒细胞增生为主,染色体t(15;17)(q22;q12)易位形成PML/RARα融合基因,早期常伴有严重的凝血功能障碍而危及生命。FAB分型将APL分二亚型：典型粗颗粒型M3,嗜苯胺蓝颗粒粗大,密集甚或融合；细颗粒型M3v,嗜苯胺蓝颗粒密集而细小。APL免疫表型特点为CD13+、CD33+和CD14-。自20世纪80年代中期以来,全反式维甲酸(ATRA)已成功用于治疗伴t(15;17)的APL。目前以ARTA联合蒽环类为基础的化疗,使初治APL患者完全缓解(CR)率达90%～95%,早期死亡率明显下降,CR后巩固强化及维持治疗(6-巯基嘌呤+甲氨喋呤+ATRA/亚砷酸交替)使得APL复发率明显下降,生存期明显延长。WANG等［1-2］报道,标危组APL其6年无病生存达86％。尽管大多数APL经过上述治疗取得了非常满意的疗效,仍有少部分APL患者表现了非常差的临床过程,出现早期死亡。我们收治的63例APL患者中13例发生早期死亡。现将13例早期死亡的APL患者形态学、免疫分型、细胞遗传学和分子生物学特点分析报道如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
13例早期死亡的APL患者来自2003年5月至2010年8月苏州大学附属第三医院（常州市第一人民医院）血液科住院治疗的患者。其中男8例,女5例；年龄11～79岁,中位年龄40岁。APL的诊断均经临床、血像、骨髓像及组织化学染色、免疫分型、染色体检查确诊,10例患者行PML/RARα融合基因检测(部分患者的遗传学资料和融合基因检测由江苏省血液病研究所完成)。常规显微镜检及细胞化学染色鉴别FAB分型,其中4例M3,9例M3v。
1.2 治疗方案
确诊APL后予以口服ATRA(45 mg•m-2•d-1)诱导分化治疗,或者ATRA(45 mg•m-2•d-1)联合亚砷酸10 mg•d-1×28 d双诱导分化治疗,并常规输注血小板及血浆补充凝血因子,输注红细胞纠正贫血,对症抗感染及支持治疗,如出现弥散性血管内凝血,则加用小剂量肝素抗凝治疗,隔日监测血常规及凝血功能。如外周血白细胞大于30×109 L-1,则加用小剂量阿糖胞苷和(或)小剂量高三尖杉酯化疗,直到获得CR。获得CR后,行4～6个疗程的巩固化疗(柔红霉素米托蒽醌高三尖杉酯碱/去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷)及两个疗程的大剂量阿糖胞苷强化治疗,予以ATRA、6-巯基嘌呤+甲氨喋呤或三氧化二砷维持治疗2年。
1.3 疗效评估标准
急性早幼粒细胞白血病CR和复发标准参见文献［3］,极早期死亡为确诊5 d内死亡,早期死亡为确诊后6～15 d内死亡。
1.4 实验主要试剂和材料
FITC-(或PE-)标记的鼠抗人CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD34、CD45、CD56、CD34、HLA-DR等单抗(mAb)及同型对照购自美国BD公司。流式细胞仪(FACScabilur型)为BD公司产品。TRIzol总RNA提取液购自美国Gibco BRL公司,逆转录酶M-MLV购自美国Promega公司,Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司。
1.5 免疫表型分析
采用流式细胞术直接免疫荧光标记法,以PE或FITC标记的各种单抗检测EDTA抗凝APL骨髓单个核细胞表面淋系抗原CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22,髓系抗原CD13、CD14、CD15、CD33,干细胞抗原CD34、HLA-DR和NK细胞CD16、CD56等的表达。采用Cellquest软件采集分析数据,每次至少分析1×104个细胞。以大于20%的白血病细胞表达荧光定为阳性。对于CD34抗原,根据文献［4］,将大于10%的白血病细胞表达荧光,定为CD34+。
1.6 RT-PCR检测PML-RARα融合基因表达
常规抽取患者骨髓液2～5 ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液(Ficoll分离液)分离单个核细胞,计数(5～10)×106细胞加TRIzol总RNA提取液1 ml,TRIzol一步法提取骨髓单个核细胞总RNA,紫外分光光度仪测定OD260、OD280吸光值,计算RNA含量。逆转录反应体积为40 μl,包括标本RNA 2 μg,六随机引物100 ng,5×逆转录buffer 5 μl,10 mmol•L-1 dNTP 1.25 μl,RNAsin 25 U,逆转录酶200 U。37 ℃ 45 min,95 ℃ 5 min,-20 ℃保存备用。参考文献［8］合成引物,ABI 9600 PCR扩增仪行多重RT-PCR检测PML/RARα融合基因不同亚型(BCR1、BCR2和BCR3),PCR产物溴乙锭染色,1.5%琼脂糖凝胶电泳成像观察结果。
1.7 统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件,各组数据以±s表示,连续变量采用t检验或Mann-Whitney test各组数据间差异,离散变量采用卡方检验各组数据间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 13例早期死亡APL患者的临床及实验检查结果
13例早期死亡APL中,极早期死亡7例,早期死亡6例。早期死亡组起病时外周血白细胞计数16.9(3.9～67.8)×109 L-1，较非早期死亡组明显升高,其中7例起病时外周血白细胞大于10×109 L-1,为高白细胞性APL；9例形态学上表现为M3v,8例为CD34+,8例CD2+,9例PML/RARα融合基因BCR3亚型,与非早期死亡组比较差异有统计学意义,有助于APL的临床预后判断,见表1。
2.2 死亡原因分析
1例死于维甲酸综合征,该例患者起病时外周血白细胞低于10×109 L-1,行维甲酸诱导分化治疗过程中,外周血白细胞进行性上升至87×109 L-1,出现典型维甲酸综合征,抢救无效死亡。其余12例均死于颅内出血,其中1例11岁儿童患者起病时颅内多发浸润灶伴颅内出血死亡。1例为Rh阴性血型,因未能及时输注血小板替代治疗而死于颅内出血。2例患者以颅内出血起病。可见，颅内出血为APL最主要死亡原因。7例患者为周末急诊入院,均延迟输注血小板而出血致死。
3 讨 论
全反式维甲酸成功用于诱导分化治疗伴t(15;17)APL,使得APL预后明显改善,成为AML预后最好的类型,但仍有少数患者死于本病早期。APL具有典型的临床特点如凝血功能障碍、染色体t(15;17)(q22;q12)易位形成PML/RARα融合基因,然而其在形态学、细胞遗传学和免疫表型水平具有明显的异质性。早期死亡是影响急性白血病缓解率及长期生存期的重要因素,因此越来越受到人们的关注。严重出血主要由于APL患者存在高凝状态诱发弥散性血管内凝血所致,往往在诊断及治疗前即发生［4-5］。本组发现APL患者早期死亡率达20.63%,略高于文献报道。这与本组存在Rh阴性患者及老年患者有关,可见临床上并不少见。
通过对本组早期死亡APL患者的实验检查分析显示,外周血高白细胞,形态学M3v、CD34+和PML/RARα融合基因BCR3亚型APL早期死亡率极高,临床预后差。王瑛等［6］认为需尽早应用三氧化二砷、DAV等方案联合化疗配合ATRA治疗,并及时处理高白细胞,积极处理DIC,包括应用冰冻血浆、血小板,应保证血小板在(30~50)×109 L-1以上,预防危及生命的颅内出血,才能预防APL患者的早期死亡,降低早期死亡率。各级临床血液科医师需足够重视APL早期出血,经验性诊断及治疗往往可以赢得宝贵的治疗时间,避免早期死亡的发生。
［参考文献］
［1］ WANG Z Y, CHEN Z. Acute promyelocytic leukemia: from highly fatal to highly curable［J］. Blood, 2008,111(5):2505-2515．
［2］ AD�S L, SANZ M A, CHEVRET S, et al.Treatment of newly diagnosed acute promyelocytic leukemia(APL): a comparison of French-Belgian-Swiss and PETHEMA results［J］. Blood, 2008,111(3):1078-1084．
［3］ 张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.3版. 北京：科学出版社,2007:106-115．
［4］ SANZ M A, MONTESINOS P. Open issues on bleeding and thrombosis in acute promyelocytic leukemia［J］. Thromb Res, 2010,125(Suppl 2):S51-54．
［5］ YANADA M, MATSUSHITA T, ASOU N， et al. Severe hemorrhagic complications during remission induction therapy for acute promyelocytic leukemia: incidence, risk factors, and influence on outcome［J］. Eur J Haematol, 2007,78(3):213-219．
［6］ 王瑛,迟景宏.全反式维甲酸、DAV方案、三氧化二砷治疗早幼粒细胞白血病的临床观察［J］.现代医学，2005，33(4)：269-270.
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”
